Fluoreszenz-, Phasenkontrast- und Biolumineszenz-Bildgebung lebender, auf einem Kunststoffboden inkubierter Zellen unter Verwendung eines 20X Phasenkontrastobjektivs mit hoher numerischer Apertur (NA)

Einführung
Bildgebung von auf Kunststoffboden inkubierten Stammzellen

Kulturschalen mit Glasboden für die Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen werden von vielen Herstellern von Inkubationskammern angeboten. Es gibt jedoch Zellen, die auf Glasoberflächen nicht kultiviert werden können und die Verwendung von Schalen mit Kunststoffboden erforderlich machen.
Bestimmte Stammzellen, beispielweise iPS-Zellen (induzierte pluripotente Stammzellen) und ES-Zellen (embryonale Stammzellen), können sich besser differenzieren, wenn sie auf einem Kunststoffsubstrat kultiviert werden. Andere Zelltypen wiederum können sich in Glasbodenschalen überhaupt nicht differenzieren. Kunststoffbodenschalen haben jedoch den Nachteil, dass die Fluoreszenzbildgebung oft durch die Autofluoreszenz des Kunststoffs erschwert wird, was zu starkem Hintergrundrauschen führt. In diesem Fall verschlechtert sich der Signal-Rausch-Abstand, und es wird schwieriger, die fluoreszierende Probe abzubilden.
In der Stammzellforschung ist es jedoch erforderlich, auch bei Verwendung von Kunststoffbodenschalen aussagekräftige Fluoreszenzuntersuchungen an Zellen durchzuführen. Genau für diesen Bedarf entwickelte Olympus ein 20X Phasenkontrastobjektiv (UCPLFLN20XPH), dessen numerische Apertur (NA) im Vergleich zu einem herkömmlichen 20X Phasenkontrastobjektiv deutlich höher ist. Dadurch erhöht sich der Signal-Rausch-Abstand und ermöglicht eine bessere Fluoreszenzbildgebung mit Kunststoffschalen, sodass der Differenzierungsprozess von Stammzellen mit Fluoreszenzbildgebung im Zeitraffer effektiver untersucht und die Konfluenz- oder Transfektionsrate von auf Kunststoffboden kultivierten Zellen einfacher beurteilt werden kann.
In diesem Anwendungshinweis erläutern wir, wie das 20X Phasenkontrastobjektiv von Olympus dank seiner hohen numerischen Apertur (NA) die Fluoreszenz- und Phasenkontrastmikroskopie von lebenden Stammzellen in einer Kunststoffbodenschale ermöglicht, und zeigen ein Beispiel für die Biolumineszenz-Bildgebung mit demselben Objektiv.

Anwendung: Fluoreszenz- und Phasenkontrastmikroskopie mit den 20X Phasenkontrastobjektiven von Olympus mit hoher NA

Murine embryonale Stammzellen (ES) mit GFP-markiertem Histon (GFP-H2B) in den Zellkernen wurden in Kunststoffbodenschalen inkubiert. Diese Zellen wurden mit einem herkömmlichen Phasenkontrastobjektiv (20X, NA = 0,4) abgebildet und dann mit Bildern verglichen, die mit einem 20X Phasenkontrastobjektiv mit hoher NA (NA = 0,7) von Olympus aufgenommen wurden. 

Murine ES-Zellen mit Expression von GFP-H2B

Zum Vergleich der Bilder oben wurden helle Fluoreszenzbilder mit dem 20X Phasenkontrastobjektiv mit hoher NA (UCPLFLN20XPH) aufgenommen. Die Zellkerne sind gut zu erkennen, da die Objektive eine höhere numerische Apertur bei gleichem Arbeitsabstand (0,8 bis 1,8 mm) haben.
Diese Bilder zeigen, dass mit dem Objektiv UCPLFLN20XPH Fluoreszenzbilder aufgenommen werden können, die mit den Aufnahmen von Glasbodenschalen vergleichbar sind. Mit Hilfe eines Korrekturrings kann die sphärische Aberration, die durch Unterschiede in der Dicke des Kunststoffschalenbodens entsteht, leicht korrigiert werden.

Fotografiebedingungen:
Präparat: Murine ES-Zellen
Fluoreszenzmarker: GFP-H2B
Inkubationskammer: Kunststoffbodenschale
Objektiv: Phasenkontrastobjektiv UCPLFLN20XPH mit hoher NA
CCD-Kamera: Digitale Mikroskopkamera DP80
Mikroskop: InversmikroskopIX73 für die Forschung

Anwendung: Erhöhung der Fluoreszenzempfindlichkeit der digitalen Mikroskopkamera CCD DP80 im monochromen CCD-Modus

Wie oben beschrieben, eignet sich das 20X Phasenkontrastobjektiv mit hoher NA von Olympus (UCPLFLN20XPH) gut für die Fluoreszenz- und Phasenkontrastmikroskopie von Zellen, die in einer Kunststoffbodenschale inkubiert wurden. Wenn eine Schale mehrmals aus dem Inkubator genommen wird, um die Fluoreszenz der Probe während der Experimente zu überprüfen, muss die durch das Anregungslicht erzeugte Fototoxizität minimiert werden. In diesem Fall kann bei Verwendung einer hochempfindlichen CCD-Kamera sowohl die Stärke des Anregungslichts als auch die Zeitdauer reduziert werden, in der die Probe potenziell zytotoxischem Licht ausgesetzt ist.
Die digitale Mikroskopkamera DP80 von Olympus erlaubt wahlweise eine farbtreue bzw. hochempfindliche monochrome CCD-Bildgebung. Wie die folgenden Bilder zeigen, konnte das in murinen IPS-Zellen exprimierte Nanog-GFP im monochromen CCD-Modus der Kamera DP80 mit dem 20X Phasenkontrastobjektiv mit hoher NA (UCPLFLN20XPH) auch bei geringerer Lichtstärke effizient detektiert werden.

In murinen IPS-Zellen exprimiertes Nanog-GFP

Fotografiebedingungen:
Präparat: Murine iPS-Zellen
Fluoreszenzmarker: Nanog-GFP
Inkubationskammer: Kunststoffbodenschale
Objektiv: Phasenkontrastobjektiv UCPLFLN20XPH mit hoher NA
CCD-Kamera: Digitale Mikroskopkamera DP80
Mikroskop: Invertiertes Forschungsmikroskop IX73

Anwendung: High-Performance-Imaging von Biolumineszenz

Das 20X Phasenkontrastobjektiv von Olympus mit hoher NA (UCPLFLN20XPH) eignet sich hervorragend für anspruchsvolle Anwendungen wie Biolumineszenz-Bildgebung mit Kunststoffbodenschalen. Die Biolumineszenz-Bildgebung ermöglicht es dem Anwender, die Genexpression auf Einzelzellebene quantitativ zu erfassen. Dieser Bildgebungsmodus kann mit dem Olympus LV200, einem speziell für die Biolumineszenz-Bildgebung entwickelten Mikroskop, problemlos angewendet werden. Bei Verwendung des Objektivs UCPLFLN20XPH mit dem LV200 können mehrere Zellen in einem einzigen Sichtfeld beobachtet werden. Wie in der Abbildung unten gezeigt, können Phasenkontrast und Nanog-Luc-Biolumineszenz (gelb) in murinen ES-Zellen auf Einzelzellenebene mit hoher Empfindlichkeit visualisiert werden.

Fotografiebedingungen:
Präparat: Murine ES-Zellen
Biolumineszenz: Nanog-Luc
Inkubationskammer: Kunststoffbodenschale
Objektiv: Phasenkontrastobjektiv UCPLFLN20XPH mit hoher NA
Mikroskop: Biolumineszenz-Imaging-System LV200

Zusammenfassung

Die vorgestellten Beispiele zeigen, dass das 20X Phasenkontrastobjektiv (UCPLFLN20XPH) von Olympus mit seiner hohen NA brillante Fluoreszenz-, Phasenkontrast- und Biolumineszenz-Bilder von Zellen liefert, die in Kulturschalen mit Kunststoffboden kultiviert werden. Das Objektiv UCPLFLN20XPH ist mit dem Z-Drift-Kompensator IX3-ZDC2 und den motorgesteuerten Inversmikroskopen der Serie IX3 für die Forschung kompatibel. Zusammen mit einem motorgesteuerten Tisch kann ein voll motorgesteuertes, zellbasiertes Assay-System für Kunststoffbodenschalen zusammengestellt werden.