Vergleich humaner iPS-Zelllinien mithilfe des Inkubator-Überwachungssystems CM20: Beobachtung der Differenzierung von iPS-Zellen zu Leberorganoiden

Einleitung

Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) werden in der embryologischen Grundlagenforschung z. B. zur Zelldifferenzierung und Organbildung, in der Arzneimittelforschung und zur Entwicklung diagnostischer Verfahren für Krankheiten häufig eingesetzt. Weltweit wird heute eine Vielzahl von iPS-Zelllinien eingesetzt, deren Eigenschaften, wie beispielsweise das Differenzierungspotenzial und die Wachstumsgeschwindigkeit, sich je nach Stamm unterscheiden. Diese Unterschiede sind zwar bekannt, bisher wurden sie allerdings noch nie anhand von Zellen quantifiziert, die unter denselben Umgebungsbedingungen kultiviert wurden. Daher ist es schwierig zu entscheiden, ob diese Unterschiede auf unterschiedliche Umgebungsbedingungen oder Kulturverfahren in den Laboren zurückzuführen sind oder aber an den Zelllinien selbst liegen. Selbst wenn von iPS-Zellen abstammende differenzierte Zellen Unterschiede in ihren Eigenschaften aufweisen, werden diese erst nach Abschluss der Kultur festgestellt. Daher können Zellen, die zur Differenzierung angeregt wurden, Anomalien aufweisen. Vor diesem Hintergrund ist ein Werkzeug wichtig, das eine langfristige Überwachung von iPS-Zellen und eine effiziente Qualitätskontrolle und Datenverwaltung während des Prozesses bis zur Differenzierungsinduktion ermöglicht.

Quantitative Analyse von Zellkulturdaten mit dem Inkubator-Überwachungssystem CM20

Mithilfe der quantitativen Messfunktionen des Inkubator-Überwachungssystems CM20 von Olympus analysierten wir Kontrollpunkte für Variationen bei der Organoidbildung durch iPS-Zellen. Außerdem erarbeiteten wir ein Verfahren für die Analyse des Krankheitsgenom-Hintergrunds basierend auf einem Vergleich mehrerer Proben. In dieser Studie wurden 12 menschliche iPS-Zelllinien von verschiedenen Spendern nach demselben Verfahren kultiviert. Die Daten zum Wachstumsprozess der einzelnen Zelllinien wurden mit dem Inkubator-Überwachungssystem CM20 von Olympus erfasst.

Kulturprotokoll

Die humanen iPS-Zellkulturen wurden in 6-Well-Platten unter Feeder-freien Bedingungen mit StemFit AK02N-Medium (Ajinomoto Co., Inc.) und iMatrix-511 (Matrixome Inc.) zur Kulturplattenbeschichtung kultiviert. Nach Vereinzelung mit Accutase-Lösung wurden sie in einer Dichte von 1,0–2,0 × 104 Zellen/Well ausgesät und in StemFit AK02N-Medium, supplementiert mit Y-27632, für 24 Stunden subkultiviert. Anschließend wurde das Medium gegen StemFit AK02N-Medium ohne Y-27632 ausgetauscht, und die humanen iPS-Zellen wurden etwa eine Woche lang kultiviert, wobei das Medium alle zwei Tage gewechselt wurde (Abb. 1).

Abb. 1: Wie humane iPS-Zellen kultiviert werden

Bilder humaner iPS-Zellen, aufgenommen mit dem Inkubator-Überwachungssystem CM20 an den Tagen 1, 4 und 7 nach dem Passagieren. Der blaue Bereich wurde mit der automatischen Kolonie-Erkennungsfunktion des Überwachungssystems identifiziert.
Der blaue Bereich wurde mit der automatischen Kolonie-Erkennungsfunktion des Überwachungssystems identifiziert.

Der Wachstumsprozess der 12 humanen iPS-Zelllinien wurde mit dem CM20-System über 5 bis 8 Passagen kontinuierlich überwacht (Abb. 2 A, B). Der Wechsel des Mediums und die Subkultivierung erfolgten bei den iPS-Zelllinien stets zur gleichen Zeit. Wir stellten fest, dass sich alle Zelllinien jeweils innerhalb von etwa 30 Stunden verdoppelten, wobei die Wachstumsgeschwindigkeit zwischen den iPS-Zelllinien leichte Unterschiede aufwies. Außerdem beobachteten wir, dass sich unter den humanen iPS-Zelllinien einige befanden (beispielsweise die Stämme B und C), deren Verdoppelungszeit bei allen Passagen nahezu konstant blieb. Dies bestätigt, dass die Kulturprozesse, beispielsweise der Mediumwechsel und die Subkultivierung, korrekt durchgeführt wurden (Abb. 2 C).

Dagegen traten bei anderen iPS-Zelllinien (beispielsweise den Stämmen I und J) von Passage zu Passage starke Unterschiede in der Verdoppelungszeit auf (Abb. 2D). Diese Ergebnisse zeigen, dass die 12 iPS-Zelllinien unterschiedliche Wachstumseigenschaften haben.

Abb. 2: Quantitative Überwachung des Proliferationsstatus während der Kultivierung humaner iPS-Zellen

(A) Software-Benutzeroberfläche des Inkubator-Überwachungssystems CM20.
(B) Beobachtung einzelner Wells mit dem Inkubator-Überwachungssystem CM20. In den Wells werden jeden Tag automatisch alle 3 Stunden Bilder von 9 Sichtfeldern aufgenommen.
(C) Verdoppelungszeit der einzelnen iPS-Zelllinien während der mehrfach durchgeführten Passagen. Der Balken gibt den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) an.
(D) Unterschiede in der Standardabweichung (SD) der Verdoppelungszeit der einzelnen iPS-Zelllinien.

Vorteile der quantitativen Analyse

Da das das Überwachungssystem CM20 quantitative Daten über den Zellwachstumsprozess aufzeichnet, können Daten für verschiedene Zelllinien unter denselben Bedingungen erhoben und verglichen werden. Das Überwachungssystem vereinfacht die Datenerfassung von mehreren Stämmen, die von einem Forschenden in demselben Prozess oder aber von mehreren Forschenden kultiviert werden. So lässt sich die korrekte Durchführung des Prozesses leichter überprüfen, indem Zellbilder und Wachstum verglichen werden.

Wenn bisher Schwankungen der Zellqualität auftraten, war es schwierig festzustellen, ob Unterschiede der Eigenschaften einzelner Zelllinien oder Abweichungen im Kulturprozess die Ursache waren. Insbesondere Studien mit iPS-Zellen erfordern häufig einen hohen Aufwand, um die gewünschten differenzierten Zellen zu erhalten. So war es schwierig zu beurteilen, wie sich Veränderungen, die während der Kultivierung von iPS-Zellen auftreten können, auf die Qualität der erhaltenen differenzierten Zellen auswirken.

In weiteren Studien mit dem CM20 wird Olympus Methoden für eine effiziente Qualitätskontrolle und Datenverwaltung bei Zellkulturexperimenten entwickeln.

Kommentar von Dr. Takebe und Dr. Yoneyama