Räumliche 3D-Analyse beim Hochdurchsatz-Screening von Arzneimitteln

3D-Hochgeschwindigkeitsaufnahmen von Krebs-Sphäroiden wurden mit der NoviSight Software analysiert, um eine genaue Bewertung der Wirksamkeit von Arzneimitteln bei mehreren Proben durchzuführen.

Einleitung

Die Beurteilung der Leistung eines Arzneimittels anhand von dreidimensionalen Krebs-Sphäroiden ist wichtig, da Sphäroide die komplexe Mikroumgebung von Krebstumoren widerspiegeln. Dies ermöglicht es Wissenschaftlern, die Wirkung eines Arzneimittels unter Parametern zu bewerten, die der natürlichen Umgebung eines Tumors ähnlicher sind. Um ein Hochdurchsatz-Arzneimittel-Screening mit Sphäroiden durchzuführen, müssen ein einfaches Protokoll, ein halbautomatisches Hochdurchsatz-Imaging-Verfahren und eine Multi-Well-3D-Analyse angewendet werden. 
In dieser Studie führten wir einen homogenen Zellviabilitätstest mit einer 384-Well-Platte ohne Flüssigkeitsaustausch durch, erfassten Hochgeschwindigkeitsaufnahmen mit dem Resonanz-Scanner des konfokalen Mikroskops FV3000RS und analysierten die Bilder mit der NoviSight 3DSoftware. Die Sphäroide wurden in 3D analysiert, um die Wirksamkeit von Arzneimitteln anhand mehrerer Proben genauer zu beurteilen.
 

Arbeitsablauf der Anwendung

Vorteile

• Verwendung eines einfachen Protokolls, bei dem ein Flüssigkeitsaustausch nicht erforderlich ist
• Automatische Erfassung von Bildern mithilfe eines Hochgeschwindigkeits-Resonanz-Scanners
• Genaue räumliche 3D-Analyse mehrerer Proben

Methoden

Vorbereitung der Zellen

HeLa-Zervixkarzinomzellen wurden in eine Corning 384-Well-Platte mit Rundboden ausgesät (100 Zellen pro Well) und 24 Stunden lang in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalem Kälberserum (FBS) kultiviert. Die Platte wurde vorsichtig zentrifugiert, um Luftblasen zu entfernen.

Probenvorbereitung

Die Proben wurden mit Cisplatin und Staurosporin (STS) in verschiedenen Konzentrationen versetzt und 24 Stunden lang inkubiert. Unter Ausnutzung der unterschiedlichen Membranpermeabilität wurde die Zellviabilität durch Zählen der gesamten und der toten Zellen (gesamte Zellen: blau/tote Zellen: grün) unter Verwendung des ReadyProbes Cell Viability Imaging Kits von Thermo Fisher Scientific bestimmt. Anschließend wurden die Proben angefärbt und fünf Stunden lang inkubiert. Bei dieser einfachen Präparationsmethode ist vom Aussäen bis zum Imaging keinerlei Flüssigkeitsaustausch, Fixieren oder Waschen erforderlich.

Bildaufnahme und Analyse

Fluoreszenzbilder der Sphäroide wurden mit dem konfokalen FV3000RS Laser-Scanning-Mikroskop mit einem semiapochromatischen LUCPFLN20X Objektiv aufgenommen. Nach Festlegen des Abbildungsbereichs wurden die Bilder vom Resonanz-Scanner des Mikroskops automatisch erfasst. Die NoviSight Software kann Daten von mehreren Bildern gleichzeitig mit Informationen über die Platte importieren, beispielsweise die Position des Wells und die Lokalisation der Probe. Anhand der importierten Daten rekonstruiert die Software die Bilder in 3D. Die NoviSight Software kann Objekte wie Zellkerne erkennen und anschließend die verschiedenen Signale der Objekte analysieren.
 

Abb. 1 Methode für das Hochdurchsatz-Screening ohne Flüssigkeitsaustausch
 

Ergebnis

Hochgeschwindigkeits-3D-Imaging mehrerer Proben

Es dauerte etwa eine Minute, um ein Z-Stapel-Bild eines einzelnen Wells aufzunehmen (2,33 μm dick, 122 Schichten, 2 Kanäle). Die Cisplatin- und STS-Behandlung bewirkte eine dosisabhängige Erhöhung der Anzahl toter Zellen (Abb. 2^*). 
 

Abb. 2 Hochgeschwindigkeits-Imaging des Ansprechens von Sphäroiden auf Arzneimittel^*
 

Hochdurchsatz-3D-Analyse der Empfindlichkeit von Sphäroiden gegenüber Arzneimittel

Anhand der Gesamtzellsignale (blau) konnten die Zellkerne erkannt werden (Abb. 3A^*). Anschließend wurden alle Zellen entweder als lebend oder als tot klassifiziert, je nach Vorhandensein oder Fehlen von grünen Signalen (Signal positiv: tote Zellen; Signal negativ: lebende Zellen). Die positiven und negativen Signale wurden durch Bestätigen des aus dem Diagramm ausgewählten Bildes klassifiziert (Abb. 3B^*). Nach der Klassifizierung können die Gesamtintensitäten der Signale toter Zellen in den Sphäroiden mit der Software anhand einer "Heat Map" dargestellt werden. 4A). Schließlich wurde der prozentuale Anteil der lebenden und toten Zellen berechnet und aufgetragen (Abb. 4B). Die Ergebnisse zeigten, dass die HeLa-Zellen gegenüber beiden Arzneimitteln hochempfindlich waren.
 

(A)

(B)

Abb. 3 Die NoviSight Software erkennt und klassifiziert Objekte anhand von Signalen^*
 

Abb. 4 Heatmap-Darstellung und Dosis-Wirkungs-Kurve

Räumliche Hochdurchsatz-Analyse der Arzneimittelempfindlichkeit

In dieser Studie wurden dreidimensionale Bilder aufgenommen, um eine erweiterte räumliche Analyse durchzuführen. Bei Verwendung der NoviSight Software kann die Zielregion für die Analyse festgelegt werden. Hier wurde die Software so eingestellt, dass bei jedem Sphäroid das Zentrum und die Peripherie analysiert werden konnten (Abb. 5A). Anschließend wurde innerhalb dieser Bereiche eine Populationsanalyse durchgeführt. Diese Methode ermöglicht eine räumliche Analyse der Wirksamkeit von Arzneimitteln an einer größeren Anzahl von Sphäroiden in einer Platte mit mehreren Wells. Die Software berechnete das Verhältnis jeder toten Zelle zur Anzahl der Zellen im zentralen und peripheren Bereich (Abb. 5B). 
In diesem Fall nahm die Anzahl toter Zellen sowohl im Zentrum als auch an der Peripherie dosisabhängig zu. Anders als Cisplatin ist Staurosporin selbst in niedrigen Konzentrationen auch im zentralen Teil des Sphäroids aktiv.
 

Abb. 5: Mit der NoviSight Software lässt sich eine erweiterte räumliche Analyse von Sphäroidregionen durchführen
 

Schlussfolgerung

Mit einem einfachen Protokoll, konfokalem Hochgeschwindigkeits-Imaging und der NoviSight Software wurden bei hohem Durchsatz 3D-Bilder zur Ermittlung der Zellviabilität und zur Analyse des Ansprechens von Sphäroiden auf Arzneimittel aufgenommen. Die räumliche Analysetechnik ermöglicht eine erweiterte Arzneimittelbewertung an mehreren Proben.

Autor

Hiroya Ishihara, Biological Evaluation Technology 2, Research and Development
 

*Obwohl sie zu einer der wichtigsten Zelllinien in der medizinischen Forschung wurde, müssen wir unbedingt anerkennen, dass Henrietta Lacks Beitrag zur Wissenschaft ohne ihre Zustimmung erfolgte. Diese Ungerechtigkeit führte nicht nur zu wichtigen Entdeckungen in der Immunologie, bei Infektionskrankheiten und Krebs, sondern warf auch wichtige Diskussionen über Datenschutz, Ethik und Einwilligung in der Medizin auf.
Um mehr über das Leben von Henrietta Lacks und ihren Beitrag zur modernen Medizin zu erfahren, klicken Sie hier.
http://henriettalacksfoundation.org/