Optimierung der Bildaufzeichnung für die 3D-Hochdurchsatzanalyse von Krebs-Sphäroiden

Zusammenfassung

In diesem Anwendungsbeispiel ermittelten wir die optimalen Einstellungen eines konfokalen Mikroskops für die Erfassung von Hochgeschwindigkeitsaufnahmen in einer Qualität, wie sie für Analyse von Krebs-Sphäroiden erforderlich ist. Zu diesem Zweck wurde eine Hochdurchsatzbewertung der Wirksamkeit von Arzneimitteln unter Verwendung einer 3D InSight Mikrogewebeplatte von InSphero durchgeführt.

・Arbeitsablauf Arzneimittelbewertung

・Optimierung der Bildgebungsbedingungen

Vorteile

• Optimierung der Bildaufzeichungseinstellungen des FV3000 Mikroskops für die Erfassung von Hochgeschwindigkeitsaufnahmen in der Qualität, die für die 3D-Analyse mit der NoviSight Software erforderlich ist.
• Die NoviSight Software kann Objekte mit niedriger Bildqualität analysieren, da sie Signalinformationen vom erkannten Objekt auf Grundlage des Zellkernsignals mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis nutzt.
   

Einleitung

Die Beurteilung der Leistung eines Arzneimittels anhand von dreidimensionalen Krebs-Sphäroiden ist wichtig Schritt, da sie die komplexe In-vivo-Mikroumgebung von Krebstumoren widerspiegeln. Dies ermöglicht es Wissenschaftlern, die Wirkung eines Arzneimittels unter Bedingungen zu bewerten, die der natürlichen Umgebung eines Tumors ähnlicher sind.

Die Aufnahme optischer Schnitte einer großen Anzahl von Proben kann jedoch zeitaufwendig sein. Um den entsprechenden Arbeitsablauf zu beschleunigen, ermittelten wir die optimalen Bildaufzeichnungseinstellungen des konfokalen FLUOVIEW FV3000RS Mikroskops für die Erfassung von Hochgeschwindigkeitsaufnahmen in einer Qualität, wie sie für die 3D-Analyse mit der NoviSight Software erforderlich ist. 

Die Optimierung der Aufnahmebedingungen, beispielsweise der Einstellung des Objektivkorrekturrings, der Schrittgröße in Tiefenrichtung und der Mittelungszeiten, ermöglichte die Aufnahme optischer Schritte von 252 Proben von 3D InSight Mikrogeweben in einer Akura 384-Well-Platte (InSphero) in 56 Minuten und 23 Sekunden. Mit der NoviSight Software konnten zahlreiche mit dem FV3000RS Mikroskop bei hoher Geschwindigkeit aufgenommene Probenbilder genau analysiert werden.

Methoden

Probenvorbereitung

3D InSight Tumor-Mikrogewebe in einer Akura 384-Well-Platte wurden von InSphero bereitgestellt. Die mit grün fluoreszierendem Protein markierte Zelllinie HCT-116 (humanes Kolorektalkarzinom) wurde zusammen mit NIH3T3-RFP-Fibroblasten aggregiert. Mit jeder Referenzverbindung wurde eine 7-tägige Behandlung (Zugabe an Tag 0 und wiederholte Zugabe an Tag 4) durchgeführt. Abbildung 1 zeigt das Platten-Layout und die Liste der Testverbindungen. Nach der Arzneimittelbehandlung wurden die Proben dreimal mit 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und über Nacht bei 4 °C mit 4 % Paraformaldehydlösung fixiert. Dann wurden die Proben mit 1x PBS gewaschen, mit 1 μM TO-PRO-3 (Thermo Fisher Scientific) in 0,1 % Triton-X-100 gefärbt und über Nacht bei 37 °C mit dem SCALEVIEW-S4 Klärungsreagenz inkubiert.

Abb. 1 Platten-Layout und Liste der Testverbindungen

Bildaufnahme und Analyse

Um in diesem Experiment eine Überlagerung von RFP und TO-PRO-3 zu vermeiden, wurden die Bilder im sequenziellen Modus aufgenommen (was doppelt so lange dauert). 
Bei der Analyse konnte bei allen Zellen der Zellkern anhand seines Fluoreszenzsignals (TO-PRO-3) erkannt werden. Alle Zellen wurden anhand des GFP- bzw. Red Fluorescent Protein (RFP) Signals entweder als HCT-116- oder als NIH3T3-Zelle klassifiziert.
 

Ergebnisse

Optimierung des Korrekturrings des Objektivs

Zuerst wurde der Korrekturring (correction collar, CC) des Objektivs optimiert, um 3D-Bilder mit hoher Auflösung und hohem Kontrast zu erhalten. Für die Bildaufnahme wurde ein UCPLFLN20X-Objektiv mit großem Arbeitsabstand und großer numerische Apertur (NA) verwendet. Die Position mit dem besten Kontrast wurde eingestellt, indem die Stellung des Einstellrades beginnend am unteren Ende nach und nach geändert wurde, wobei sich CC = 0,17 als optimal herausstellte (Abb. 2). Daher wurde der CC zur Beobachtung einer Akura 384-Well-Platte mit einem UCPLFLN20X Objektiv auf 0,17eingestellt.

Abb. 2 Optimierung des Korrekturrings des Objektivs (Maßstabsbalken = 100 μm)

Optimierung der Z-Achsen-Schrittgröße

Als Nächstes wurde der Einfluss der Z-Achsen-Schrittgröße auf die Objekterkennung und die Analyse mit der NoviSight Software untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die Genauigkeit der Erkennung proportional zur Schrittgröße abnahm (Abb. 3). Die kleinste Schrittgröße (1,28 μm) entspricht der Hälfte der Tiefenauflösung und wurde als Referenz verwendet. Nach der Klassifizierung zeigte die Anzahl der beiden Zelltypen zwischen der Mindestschrittgröße von 1,28 μm und 3 μm keinen signifikanten Unterschied (t-Test nach Student). Die Größe des Zellkerns beträgt etwa 10 μm, sodass bei dieser Schrittgröße pro Zellkern etwa drei Bilder aufgenommen werden können.

Abb. 3 Optimierung der Schrittgröße

Optimierung der Mittelungszeiten (Resonanz-Scan-Modus)

Die Bildqualität des Resonanz-Scans des FV3000RS Mikroskops hängt von der Anzahl der Mittelungszeiten ab. Um die für die Analyse mit der NoviSight Software erforderliche Bildqualität zu erhalten, wurde die Anzahl der Mittelungszeiten optimiert. Die NoviSight Software erkennt zu analysierende Objekte am Fluoreszenzsignal, daher ist die Verwendung eines hochauflösenden Bildes nicht erforderlich. Bei diesem Experiment werden Zellkerne mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis zur Objekterkennung herangezogen, sodass es ausreicht, in anderen Kanälen (GFP/RFP) nur Intensitätsinformationen zu erfassen. Beim Vergleich der mit dem Galvano-Scan erzielten Erkennungsgenauigkeit mit dem gemittelten Bild des Resonanz-Scans zeigte sich, dass die Erkennungsgenauigkeit nahezu der Kontrolle entsprach, selbst wenn keine Mittelung durchgeführt wurde (t-Test nach Student) (Abb. 4). Mit diesem Experiment wurde belegt, dass die Bildqualität ohne Mittelung für die NoviSight Analyse ausreichend war.

Abb. 4 Optimierung der Mittelungszeiten

Imaging unter optimierten Bedingungen

Die Optimierung der obigen Bedingungen (Abb. 5A) ermöglichte die Erfassung von 252 Proben von 3D InSight Mikrogeweben in Akura 384-Well-Platten (InSphero) in 56 min 23 s (Abb. 5B). Die Ergebnisse zeigen, dass alle Arzneimittel das Wachstum von Sphäroiden in Abhängigkeit von der Dosis inhibieren. Darüber hinaus reduzierte die Behandlung mit hohen Konzentrationen von Sunitinib, einem gegen ein bestimmtes Molekül gerichteten Arzneimittel, das den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) hemmt, signifikant die Intensität des grün fluoreszierenden Proteins (GFP). Dies deutet darauf hin, dass es nur auf Krebszellen (GFP-markierte HCT-116) wirkt.

Analyse

Nach Erkennung der Zellen (Abb. 6A), ist es einfach, mit der NoviSight Software unter Verwendung einer Heatmap die Gesamtzahl der Zellen in den einzelnen Sphäroiden zu ermitteln (Abb. 6B). Nach der Klassifizierung wurde der jeweilige prozentuale Anteil der beiden Zelltypen berechnet und aufgetragen (Abb. 6C). Die Analyseergebnisse zeigten, dass Sunitinib das Wachstum von Krebszellen inhibierte (HCT-116, IC50 = 1,46 μM). Es war möglich, durch Hochgeschwindigkeits-Imaging mit dem FV3000RS System unter optimierten Bedingungen eine ausreichende 3D-Arzneimittelbewertung durchzuführen.

(C)

Fig. 6 Three-dimensional efficacy drug evaluation

Schlussfolgerung

252 Proben von 3D InSight Mikrogeweben in Akura 384-Well-Platten (InSphero) wurden mit dem konfokalen FV3000RS Mikroskop unter Bedingungen aufgenommen, die für das Hochdurchsatz-Imaging optimiert waren. Diese Studie zeigt, dass die Bildaufnahme innerhalb von einer Stunde abgeschlossen und eine 3D-Analyse mit der NoviSight Software durchgeführt werden kann. Durch Anpassung der Farbstoffkombination und der Probengröße könnte der Durchsatz möglicherweise noch weiter gesteigert werden.

Autor

Hiroya Ishihara, Biological Evaluation Technology 2, Research and Development
Takashi Sugiyama, Biological Evaluation Technology 2, Research and Development