Fluoreszenzbildanalyse – Zellteilung in Sphäroiden

Die Zellteilung im Inneren von Sphäroiden kann durch die Anfärbung von Zellkernen und Mikrotubuli visualisiert werden. Die Anzahl der mitotischen Zellen in Sphäroiden kann anhand von Bildern, die mit einem konfokalen Lasermikroskop aufgenommen wurden, und unter Verwendung der NoviSight Software quantitativ bestimmt werden.

Ziele

Der Malignitätsgrad von Krebsgewebe wird durch die Zählung der Zellen bestimmt, die sich in Mitose oder in atypischer Mitose befinden. Die Anzahl mitotischer Krebszellen wird in der Regel mittels Durchflusszytometrie ermittelt. Bei dieser Technik wird das Krebsgewebe dissoziiert und die Zellkerne werden angefärbt, um die mitotischen Zellen zu zählen, unabhängig davon, ob es sich um eine 2D- oder eine 3D-Zellkultur handelt. Da bei der Durchflusszytometrie die ursprüngliche 3D-Struktur von Geweben nicht dargestellt werden kann, ist es wichtig, die Lokalisation der in Mitose befindlichen Zellen innerhalb des Krebsgewebes festzustellen. Außerdem ist es schwierig, den Zusammenhang zwischen morphologischen Informationen wie der Tumorgröße und der Zellteilung zu analysieren. In dieser Studie wurden die mitotischen Zellen im Innern eines intakten Tumor-Sphäroids durch Anfärben des Zellkerns und der Mikrotubuli sowie anschließende Gewebeklärung erfolgreich visualisiert. Diese Methode, in Kombination mit der Anwendung der NoviSight Software, erlaubte die Bestimmung der Anzahl mitotischer Zellen. Die quantitative Analyse der Bilder machte es außerdem möglich, die Lokalisation derjenigen Zellen festzustellen, die sich in der Mitose oder in atypischer Mitose befinden.

Vorbereitung der Proben

Eine Suspension aus HT-29-Zellen wurde mit einer Dichte von 500 Zellen/Well in eine PrimeSurface 96U Platte (SUMITOMO BAKELITE CO., LTD, Japan) gegeben. Nach 5 Tagen in Kultur bildeten die Zellen Sphäroidstrukturen, die anschließend mit verschiedenen Konzentrationen von Paclitaxel behandelt wurden. Nach der Zugabe von Paclitaxel wurden die Sphäroide 48 Stunden lang inkubiert und mit 4 % Formaldehyd inkubiert. Zellkerne und Mikrotubuli wurden mit Hoechst 33342 (DOJINDO) bzw. einem mit Alexa Fluor 488-konjugierten Tubulin-Antikörper (eBioscience) angefärbt. Die gefärbten Sphäroide wurden mit einem gewebeklärenden Reagenz, ScaleS, über Nacht bei 37 °C behandelt.

Schlussfolgerung
Aufnahme und Analyse von Fluoreszenzbildern

Mit dem konfokalen FV3000 Laser-Scanning-Mikroskop wurden konfokale Fluoreszenzbilder von Sphäroiden aufgenommen. In der unbehandelten Kontrollgruppe wurde eine Spindelbildung in Sphäroiden, ein spezifisches Merkmal von mitotischen Zellen, in drei Zellschichten ab der Sphäroidoberfläche beobachtet (A). Mit der NoviSight Software wurde die Anzahl der in Mitose befindlichen Zellen in der Kontroll- und der mit Paclitaxel behandelten Gruppe (B, C) gezählt. Die Ergebnisse zeigen, dass Paclitaxel die Anzahl mitotischer Zellen in Abhängigkeit von seiner Konzentration erhöhte (D). Die Ergebnisse illustrieren darüber hinaus die Wirkung von Paclitaxel als Inhibitor der Mikrotubuli-Depolymerisation.

PrimeSurface ist ein eingetragenes Warenzeichen von Sumitomo Bakelite Co., Ltd., Japan.
Olympus ist ein eingetragenes Warenzeichen. NoviSight und Insightful Analysis, Intelligent Answers sind Warenzeichen der Olympus Corporation.