Zellzählung – Bestimmung der Zellzahl in Sphäroiden

Konfokale Mikroskopie im Kombination mit dem Zell-Imaging-Analysesystem ermöglicht das Zählen von Zellen in Sphäroiden anhand von Querschnittsbildern der Sphäroide.

Ziele

Die Zellzahl ist einer der wichtigsten Parameter, den man bei Assays mit Zellen kennen muss. Das gilt auch für die Analyse von Sphäroiden. Die Zellzählung mit dem Hämozytometer erfordert eine Zellsuspension, die durch Auflösen der Sphäroide mit Trypsin hergestellt wird. Dabei gehen jedoch die besonderen Eigenschaften der Sphäroide verloren, die sich aus ihrer 3D-Struktur ableiten. In dieser Studie wurde eine nicht destruktive Zellzählung an Sphäroiden durchgeführt. Hierzu wurde die Anzahl der Zellen in Querschnittsbildern von Sphäroiden durch Konfokalmikroskopie in Kombination mit einem Zellanalysesystem bestimmt. Die Ergebnisse wurden mit denjenigen verglichen, die mithilfe eines Hämozytometers erhalten wurden.

Vorbereitung der Proben

Eine Suspension aus HeLa- oder HT-29-Zellen wurde mit einer Dichte von 500 Zellen/Well auf eine PrimeSurface 96U Platte (SUMITOMO BAKELITE CO., LTD, Japan) gegeben. 48 Stunden nach Beginn der Zellkultur wurden die einzelnen Sphäroide geerntet. Eine Hälfte jedes Sphäroids wurde in 4 % Formalin fixiert, mit Hoechst 33342 gefärbt und über Nacht transparent gemacht1. Die verbliebene Hälfte jedes Sphäroids wurde über Nacht mit Trypsin gefärbt, um die Zellsuspension herzustellen.

1) Susaki et.al. Cell. 2014 Apr 24;157(3):726-39. doi: 10.1016/j.cell.2014.03.042. Epub 2014 Apr 17.

Schlussfolgerung
Zellzählung mit dem Zellanalysesystem und dem Hämozytometer

Fluoreszenzbilder der oben genannten Sphäroide wurden mithilfe des Systems erhalten. (Exz.: 405 nm, Em.: 488 nm). Für die Zellzählung nimmt das System Querschnittsbilder der Sphäroide in Abständen von 20 µm auf und identifiziert und zählt anschließend die sichtbaren Zellen (Abbildung 1^*). Als Nächstes wird die Anzahl der Zellkerne addiert, um die Gesamtzahl der Zellen im vollständigen Sphäroid zu ermitteln (Systemzählung). Die Ergebnisse wurden mit denjenigen verglichen, die mithilfe eines Hämozytometers erhalten wurden (manuelle Zählung), wie in Abbildung 2 dargestellt (Balken: SD; n = 6). Diese Ergebnisse zeigen, dass das System die Zellzählung von Sphäroiden ermöglicht, ohne dass ihre strukturelle Integrität verloren geht oder die Sphäroide mit Trypsin aufgelöst werden müssen.

PrimeSurface ist ein eingetragenes Warenzeichen von Sumitomo Bakelite Co., Ltd., Japan.
Olympus ist ein eingetragenes Warenzeichen. NoviSight und Insightful Analysis, Intelligent Answers sind Warenzeichen der Olympus Corporation.

* Obwohl sie zu einer der wichtigsten Zelllinien in der medizinischen Forschung wurde, müssen wir unbedingt anerkennen, dass Henrietta Lacks Beitrag zur Wissenschaft ohne ihre Zustimmung erfolgte. Diese Ungerechtigkeit führte nicht nur zu wichtigen Entdeckungen in der Immunologie, bei Infektionskrankheiten und Krebs, sondern warf auch wichtige Diskussionen über Datenschutz, Ethik und Einwilligung in der Medizin auf.
Um mehr über das Leben von Henrietta Lacks und ihren Beitrag zur modernen Medizin zu erfahren, klicken Sie hier.
http://henriettalacksfoundation.org/