3D-Analyse von Krebs-Kokultursphäroiden mit der NoviSight Software

http://henriettalacksfoundation.org/Konfokale Bilder von Kokultur-Sphäroiden wurden mit der NoviSight Software quantitativ analysiert, um ihre Zellpopulation zu untersuchen und die Arzneimittelempfindlichkeit in den einzelnen Zellen zu beurteilen.

Einleitung

Die Beurteilung der Leistung eines Arzneimittels anhand von dreidimensionalen Krebs-Sphäroiden ist wichtig, da die Sphäroide die komplexe Mikroumgebung von Krebstumoren widerspiegeln. Dies ermöglicht es Wissenschaftlern, die Wirkung eines Arzneimittels unter Parametern zu bewerten, die der natürlichen Umgebung eines Tumors ähnlicher sind.

Um die Anwendbarkeit der NoviSight 3D-Analysesoftware für diese Anwendung zu testen, wurden Krebs-Kokultursphäroide von A549- und HeLa-Zellen hergestellt. Daraufhin wurden die Wirkungen einer Arzneimittelbehandlung auf diese Sphäroide einer dreidimensionalen Analyse unterzogen. Diese Studie zeigte, dass die NoviSight Software erfolgreich eingesetzt werden kann, um Objekte entsprechend den Informationen, die sie enthalten, zu klassifizieren und die Parameter jedes einzelnen zu analysieren. Auf diese Weise lässt sich die Wirkung eines Arzneimittels beurteilen.

Grafische Zusammenfassung

Vorteile

• Auf Grundlage der Signale können zwei Zelltypen klassifiziert werden, und es lässt sich eine Populationsanalyse durchführen.
• Die Wirkung des Arzneimittels kann räumlich analysiert werden, indem die Sphäroide in zentrale und periphere Bereiche getrennt werden.

Methoden

Vorbereitung der Zellen

Humane A549-Lungenzellen und HeLa-Zervixkarzinomzellen (EGPF im Zellkern exprimiert) wurden in unterschiedlichen Verhältnissen gemischt. Der Anteil der HeLa-Zellen wurde je nach der Intensität des EGFP-Signals korrigiert (Abb. 1^*1). Die Zellen wurden in eine Corning 384-Well-Platte mit Rundboden ausgesät (200 Zellen pro Well) und 3 Tage lang in DMEM mit 10 % FBS inkubiert. Die Platte wurde vorsichtig zentrifugiert, um etwaige Luftblasen aus den Wells zu entfernen.

A549: HeLa-EGFPnls

Abbildung 1: Herstellung von Krebs-Kokultursphäroiden^*1

Probenvorbereitung

Die Proben wurden 5 Stunden lang mit Staurosporin (STS) in Konzentrationen von 3,7 nM bis 3,75 μM inkubiert, um ein Verhältnis von A549- zu HeLa-Zellen in den Sphäroiden von 1:1 zu erhalten. Unter Nutzung des Unterschieds in der Membranpermeabilität wurde die Zellviabilität bestimmt, indem alle Zellkerne mit 10 μM Hoechst 33342 (DOJINDO) und die Zellkerne von toten Zellen mit 1 μM TO-PRO3 (Thermo Fisher Scientific) angefärbt wurden. Anschließend wurden die Proben dreimal mit 1x PBS gewaschen und über Nacht bei 4 °C mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Vor der Bildaufnahme wurden die Sphäroide über Nacht bei Raumtemperatur mit SCALEVIEW-S4 Gewebeklärungsreagenz (FUJIFILM Wako) behandelt.

Bild und Analyse

Fluoreszenzbilder der Sphäroide wurden mit dem konfokalen FLUOVIEW FV3000 Laser-Scanning-Mikroskop mit einen A Line Superachromat-Objektiv (UPLSAPO30XS) aufgenommen. Der Korrekturring des Objektivs wurde entsprechend dem Brechungsindex der Immersionsflüssigkeit eingestellt, um qualitativ hochwertige Bilder zur 3D-Morphologie zu erhalten. Einige der Bilder wurden zur dreidimensionalen Rekonstruktion in die NoviSight 3D-Zellanalyse-Software importiert. Die NoviSight Software kann Objekte beispielsweise Zellkerne erkennen und die Signale der Objekte auf verschiedene Weise analysieren.

Ergebnisse

Imaging der Arzneimittelempfindlichkeit von Kokultur-Sphäroiden

Imaging von transparent gemachten Sphäroiden mit dem konfokalen FV3000 Laser-Scanning-Mikroskop ermöglichte die Abbildung von Kokultur-Krebssphäroiden in der Tiefe. Staurosporin bewirkte eine dosisabhängige Erhöhung der Anzahl toter Zellen (Abb. 2^*1). Um festzustellen, welche und wie viele tote Zellen in einer dreidimensionalen Zellmasse vorliegen, ist eine dreidimensionale Analyse erforderlich.

Abbildung 2: Ansprechen auf Arzneimittel bei Kokultur-Sphäroiden^*1

Analyse der Arzneimittelempfindlichkeit von Kokultur-Sphäroiden

Die Hoechst 33342 Signale erlaubten die Erkennung der Zellkerne. Alle Zellen wurden auf Vorhandensein oder Fehlen eines EGFP-Signals in zwei Gruppe eingeteilt: EGFP-positiv (HeLa-Zellen) und EGFP-negativ (A549-Zellen). Die Zellen in diesen zwei Gruppen wurden entsprechend dem Vorhandensein oder Fehlen von Signalen für tote Zellen (TO-PRO3, rot) weiter unterteilt, sodass sich insgesamt vier Gruppen ergaben (Abb. 3^*1). Der prozentuale Anteil der lebenden und toten A549- bzw. HeLa-Zellen wurde berechnet und aufgetragen (Abb. 4). Die Ergebnisse zeigten, dass die HeLa-Zellen gegen Staurosporin empfindlicher waren als die A549-Zellen.

Mithilfe der NoviSight Software war es möglich, die in den einzelnen Kokultur-Krebssphäroiden enthaltenen Zelltypen zu klassifizieren und das zelltypspezifische Ansprechen auf Arzneimittel zu analysieren.

Abbildung 3: Die NoviSight Software ermöglicht die Klassifizierung der Zellen in 4 Gruppen auf Basis ihrer Signale^*1
*2 Auf den Bildern rechts sind die Hoechst 33342 Signale nicht angezeigt
 

Staurosporin-Konzentration

Abbildung 4. Unterschiedliches Ansprechen von A549- und HeLa-Zellen auf Arzneimittel

Strategie der räumlichen Analyse

Die Bilder werden dreidimensional erfasst, sodass eine komplexere räumliche Analyse durchgeführt werden kann. Dies ermöglicht die Untersuchung des Zellverhaltens in heterologen Geweben wie Krebstumoren. Mit der NoviSight Software kann der zu analysierende Bereich begrenzt werden. Die Software wurde so eingestellt, dass sowohl das Zentrum als auch die Peripherie der einzelnen Sphäroide untersucht wurde, was acht Gruppen ergab (Abb. 5). Anschließend wurde innerhalb dieser Bereiche eine Populationsanalyse durchgeführt (Abb. 6). Diese Methode ermöglicht die räumliche Analyse der Wirksamkeit von Arzneimitteln in Kokultur-Krebssphäroiden.

Abbildung 5: Schematische Darstellung der räumlichen Analyse
 

Abbildung 6: Mit der NoviSight Software kann eine Klassifizierung sowohl in den zentralen als auch den peripheren Teilen vorgenommen werden.

Räumliche Analyse der Wirksamkeit von Arzneimitteln

Mit der NoviSight Software kann nicht nur die Anzahl toter Zellen bestimmt, sondern auch die räumliche Wirksamkeit des Arzneimittels untersucht werden. Um diese Funktionalität zu demonstrieren, wurde eine räumliche Analyse aller toten Zellen in den Kokultur-Sphäroiden durchgeführt. Das Verhältnis jeder toten Zelle zur Anzahl der Zellen im zentralen und peripheren Bereich wurde berechnet (Abb. 7). In diesem Fall bestand zwischen diesen beiden Bereichen kein Unterschied hinsichtlich der Wirksamkeit von Arzneimitteln. Die Anzahl toter Zellen nahm sowohl im Zentrum als auch an der Peripherie dosisabhängig zu.

Staurosporin-Konzentration

Abbildung 7. Unterschied beim Ansprechen auf Arzneimittel zwischen dem zentralen und dem peripheren Bereich

Schlussfolgerung

Mithilfe der NoviSight Software und des konfokalen FLUOVIEW FV3000 Laser-Scanning-Mikroskops war es möglich, die in Kokultur-Krebssphäroiden enthaltenen Zelltypen zu klassifizieren und das zelltypspezifische Ansprechen auf Arzneimittel zu analysieren. Durch Veränderung der Zellkombination in Kokulturen lässt sich die Mikroumgebung verschiedener Krebsarten nachbilden und die Wirkung von Krebsmedikamenten kann untersucht werden.

Autoren

Hiroya Ishihara, Biological Evaluation Technology 2, Research and Development

*1 Obwohl sie zu einer der wichtigsten Zelllinien in der medizinischen Forschung wurde, müssen wir unbedingt anerkennen, dass Henrietta Lacks Beitrag zur Wissenschaft ohne ihre Zustimmung erfolgte. Diese Ungerechtigkeit führte nicht nur zu wichtigen Entdeckungen in der Immunologie, bei Infektionskrankheiten und Krebs, sondern warf auch wichtige Diskussionen über Datenschutz, Ethik und Einwilligung in der Medizin auf.
Um mehr über das Leben von Henrietta Lacks und ihren Beitrag zur modernen Medizin zu erfahren, klicken Sie hier.
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