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Anwendungshinweis

Untersuchung der Wirksamkeit von Arzneimitteln – Ansprechen kokultivierter Sphäroide auf Arzneimittel


Die Konfokalmikroskopie in Kombination mit dem Bildanalysesystem ermöglicht die Untersuchung der Wirksamkeit von Arzneimitteln in mit einem geeigneten Fluoreszenzfarbstoff gefärbten Sphäroiden.

Ziele

Die Mehrzahl der Wirksamkeitsuntersuchungen von Krebsmedikamenten stützt sich auf die Verwendung immobilisierter Zellen, die als 2D-Monolagen kultiviert werden. Diese 2D-Monolagen können jedoch das komplexe native Milieu von Krebszellen, beispielsweise das in einer 3D-Struktur, nicht nachbilden. Daher sind 3D-Zellkulturen wie Sphäroide von Interesse. Außerdem haben sich Kokultur-Sphäroidsysteme aus zwei oder mehr Zelltypen als nützlich für die Untersuchung von interzellulären Interaktionen oder Zellaktivierungsmechanismen erwiesen. In dieser Studie wurde die Wirkung von Chloroquin (CHL) auf Kokultur-Sphäroide aus U20S- und HT-29-Zellen durch Fluoreszenzbildanalyse mit dem Bildanalysesystem analysiert.

Objectives

Vorbereitung der Proben

Eine Suspension aus YFP-exprimierenden transgenen U20S- und HT-29-Zellen wurde mit einer Dichte von 50 transgenen U20S-Zellen/Well und 450 HT-29-Zellen/Well in eine PrimeSurface 96U Platte (SUMITOMO BAKELITE CO., LTD, Japan) gegeben. 48 Stunden nach Beginn der Zellkultur wurde den einzelnen Wells seriell verdünntes CHL zugesetzt. 48 Stunden nach dem Zusatz von CHL wurden allen Wells Hoechst 33342 (Farbstoff zum Anfärben von Zellkernen) und Propidiumiodid (PI, Farbstoff zum Anfärben toter Zellen) hinzugefügt. Die Beobachtung der YFP-Fluoreszenz ermöglicht die Unterscheidung zwischen U20S- und HT-29-Zellen.

Schlussfolgerung
Aufnahme und Analyse von Fluoreszenzbildern

Es wurden Fluoreszenzbilder der oben beschriebenen Sphäroide aufgenommen. Wie in den Abbildungen erkennbar, ging bei den Kokultur-Sphäroiden mit steigender CHL-Konzentration zunehmend die Integrität ihrer 3D-Struktur verloren. Interessanterweise zerstreuten sich die HT-29-Zellen vollständig, während die U20S-Zellen (grün in der Falschfarbendarstellung) aggregiert blieben. Außerdem nahm das Verhältnis toter Zellen zur Gesamtzahl der Zellen (rot bzw. blau in der Falschfarbendarstellung) in allen Wells mit steigender CHL-Konzentration zu. Das Verhältnis kann unter Verwendung der bei der Identifizierung und Zählung der Zellkerne mit der Analysesoftware erhaltenen Ergebnisse gegen die CHL-Konzentration grafisch aufgetragen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich die Wirksamkeit von Arzneimitteln mit Kokultur-Sphäroiden in einer Mikroplatte leicht untersuchen lässt.

Schlussfolgerung

PrimeSurface ist ein eingetragenes Warenzeichen von Sumitomo Bakelite Co., Ltd., Japan.
Olympus ist ein eingetragenes Warenzeichen. NoviSight und Insightful Analysis, Intelligent Answers sind Warenzeichen der Olympus Corporation.

Verwendete Produkte

3D-Zellanalyse-Software

NoviSight

  • 3D-Bilderkennung – von der kompletten Struktur bis in den subzellulären Bereich
  • Statistische Analyse
  • Verschiedene Standardassays

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