Die Durchflusszytometrie ist eine der wichtigsten Techniken zur Identifizierung und Differenzierung von Zellpopulationen, weil sich damit große Zellpopulationen mithilfe von Fluoreszenzmarkern relativ schnell beurteilen lassen. Sie weist jedoch gewisse Einschränkungen auf, die andere Techniken erforderlich machen. Mit der Weiterentwicklung von Bildanalysetools hat sich die Bildzytometrie als bessere Möglichkeit bei der Analyse großer Zellpopulationen erwiesen, die noch mehr Informationen bereitstellt.

In diesem Blogartikel betrachten wir die Durchflusszytometrie im Detail und befassen uns damit, inwiefern die leistungsstarken Tools der Bildzytometrie der wissenschaftlichen Arbeit zugutekommen.

Was ist Durchflusszytometrie?

Die Durchflusszytometrie zählt seit Jahrzehnten mit zu den wichtigsten Techniken für die Identifizierung und Analyse von molekularen Markern in Zellpopulationen. Dabei werden Zellen zu einer Einzelzellsuspension dissoziiert und mit Antikörpern gegen die jeweils relevanten Marker gekennzeichnet, wobei die Antikörper an Fluoreszenzfarbstoffe gekoppelt sind. Diese Zellen werden dann durch ein Durchflusszytometer geleitet, wo sie einzeln hinsichtlich der Expression der einzelnen Marker analysiert werden können. Diese Analyse liefert aussagekräftige quantifizierbare Daten über die vorhandene Zellpopulation.

Die Durchflusszytometrie ist eine grundlegende Technik zur Quantifizierung des Vorhandenseins und der Intensität von Proteinen auf den jeweils relevanten Zellen und ermöglicht eine Differenzierung und Identifizierung von Zellpopulationen und das Sortieren von Zelltypen.

Nachteile der Durchflusszytometrie

Auch wenn die Durchflusszytometrie große Mengen quantifizierbarer Daten auf zellulärer Ebene liefern kann, weist sie doch Nachteile auf, da die Messungen einzelner Zellen in einer Zellsuspension erfolgt.

Nachteile der Durchflusszytometrie:

• Viele Zellen werden adhärent an Gewebekulturplatten und Trägern oder in Geweben oder Strukturen zusammen mit anderen Zellen kultiviert. Sobald die Zellen aus ihrer Umgebung gelöst werden, kann sich ihre Proteinexpression verändern. Zudem können Daten über Proteinwechselwirkungen zwischen den Zellen verloren gehen.
• Es lassen sich zudem keine Daten über die Zellmorphologie und über die Position der molekularen Marker auf der Zelle erhalten.
• Während der Durchflusszytometrie sind die Zellen Stress ausgesetzt, was sich auf ihre Wachstumsfähigkeit nach der Analyse auswirken kann. Oft überlebt eine große Anzahl Zellen den Prozess nicht.
• Die in einem Durchflusszytometer verwendeten Tools beschränken die Darstellung auf quantitative Daten in Diagrammen. Eine visuelle Auswertung der Zellen ist nicht möglich.

Aufgrund dieser Nachteile wird die durchflusszytometrische Analyse häufig durch eine immunhistochemische Färbung von Zellen in ihrer Umgebung ergänzt. Die meisten Bildanalysetools sind jedoch nicht in der Lage, dieselbe quantitative Datenmenge zu liefern, und es ist nicht möglich, strukturelle Merkmale auf einzelnen Zellen 1:1 mit der durchflusszytometrischen Analyse in Korrelation zu setzen.

Das sich stetig erweiternde Gebiet der Bildzytometrie bietet Lösungen für genau dieses Problem, indem Bildgebungsanalysetools eingesetzt werden, die quantitative Daten zu Populationen liefern können, die zu denen in der Durchflusszytometrie äquivalent sind. Unsere scanR High-Content Screening Station und Software sind Beispiele für Tools, die diese Anforderungen erfüllen können.

Vorteile der Bildzytometrie

Bei der Bildzytometrie werden die Zellen direkt in ihrer Kulturumgebung abgebildet. Dann werden die Bilder verarbeitet und in quantitative Analysen der relevanten Parameter umgesetzt.

Vorteile der Bildzytometrie:

• Reduziertes Risiko von Veränderungen der Proteinexpression, die durch Dissoziation verursacht werden.
• Daten zur Zellmorphologie und Proteinlokalisierung bleiben erhalten und lassen sich in quantitative Analysen integrieren. So kann beispielsweise die Zellpopulation bestimmt werden, die einen Marker in hohem Maße im Zellkern exprimieren.
• Die Zellen sind während der Analyse keinem physischen Stress ausgesetzt. Zudem kann bei der Bildzytometrie KI-Technologie genutzt werden, um Zellen und zelluläre Merkmale mit minimaler oder keiner Färbung zu identifizieren. Dies macht es leichter, die Zellen nach der Analyse weiter zu kultivieren.
  

  (A) Hellfeldbild von markerfreien Zellen. (B) KI-gestützte Prognose der Lokalisierung von Aktin

• Dieselben Zellen können im Zeitverlauf überwacht und rückverfolgt werden. Dies kann zum Beispiel in der Wirkstoffforschung und bei der Zelldifferenzierung sehr nützlich sein. Wenn beispielsweise die Wirkung eines Arzneimittels auf primäre Patientenzellen im Zeitverlauf mittels Durchflusszytometrie untersucht werden sollte, mussten für jeden Zeitpunkt eigene Replikate kultiviert und verwendet werden, da eine Dissoziation vorgenommen werden musste. Da sich die Zellen bei der Bildzytometrie aber in einer Zellkultur befinden, kann ein und dasselbe Replikat zu unterschiedlichen Zeitpunkten gemessen werden.

Für Wissenschaftler, die mit der Durchflusszytometrie vertraut sind, ist die Umstellung auf die Datenanalyse mittels Bildzytometrie über die scanR Software kein Problem, da ähnliche Histogramme und Streudiagramme zur Darstellung der Daten verwendet werden. Genau wie bei der Durchflusszytometrie können Zellpopulationen in bestimmten Bereichen in den Diagrammen ausgewählt werden, um mehrstufige Analysen durchzuführen. Der Unterschied liegt aber darin, dass jeder ausgewertete Parameter mit dem Bild korreliert und visuell bestätigt werden kann, da die Daten direkt aus den Bildern stammen.

Betrachten Sie das folgende Beispiel. In der scanR Software lässt sich ein beliebiger Datenpunkt auswählen, um die fragliche Zelle zu betrachten, oder eine Bildergalerie einer bestimmten Zellpopulation erstellen. Dies bietet eine zusätzliche visuelle Sicherheit, dass die Zellpopulationen korrekt getrennt sind und tatsächlich die gewünschten Zellpopulationen identifiziert werden können.

Bildzytometrie in der scanR Software. A) Die als Zellen identifizierten Punkte werden als Histogramm dargestellt (B). Die Zellen werden dann in zwei Zellpopulationen aufgeteilt, die in Bildergalerien (C, D) angezeigt werden können.

Kurz zusammengefasst, können bei der Bildzytometrie mit der scanR Software einige der besten Analysetools aus der Durchflusszytometrie genutzt und mit den Vorteilen der bildbasierten Analyse kombiniert werden. Die folgende Tabelle enthält eine Aufstellung einiger Vorteile:

Die vielseitigen Tools der Bildzytometrie ermöglichen es, große Zellpopulationen basierend auf einem beliebigen sichtbaren Merkmal (Morphologie, Position, Fluoreszenzintensität und -lokalisierung usw.) zu quantifizieren und auszuwerten, ohne dass eine aufwändige Manipulation der Zellen erforderlich ist. Somit lassen sich aus Experimenten umfassendere und detailliertere Erkenntnisse gewinnen, was zu einer höheren Qualität und zu einer effizienteren Forschung führt.

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