Objektive für konfokale Mikroskope

Bei herkömmlichen optischen Mikroskopkonfigurationen ist das Objektiv die wichtigste Komponente des Systems und bestimmt den Informationsgehalt des Bildes. Die Konstruktion des Objektivs und seine Leistung unter den jeweiligen Beobachtungsbedingungen bestimmen den Bildkontrast, die Auflösung feiner Probendetails, die Tiefe innerhalb der Probe, aus der Informationen gewonnen werden können, und die laterale Ausdehnung des Bildfeldes. Bei konfokalen Scanning-Verfahren muss das Objektiv weitere Anforderungen erfüllen, da es hier auch als Beleuchtungskondensor dient und häufig in einem großen Wellenlängenbereich und bei sehr geringen Lichtstärken mit hoher Präzision arbeiten muss, ohne dass inakzeptables Bildrauschen entsteht.

Unabhängig von der Funktion der anderen Systemkomponenten enthält das Bild nur die Informationen, die das Objektiv ursprünglich erfasst hat. Bestimmte Zwischenkomponenten im Abbildungspfad können zwar Korrekturfunktionen übernehmen, doch von diesen Komponenten wird vor allem erwartet, dass sie die vom Objektiv empfangenen grundlegenden Bildinformationen so wenig wie möglich beeinträchtigen. Normalerweise spielen bei der Auswahl von Objektiven für eine bestimmte Anwendung in erster Linie die Vergrößerung, die Art des Objektivs (Trocken- oder Immersionsobjektiv) und die numerische Apertur des Objektivsystems eine Rolle. Doch technologische Verbesserungen bei Lasern und Fluoreszenzfarbstoffen, neue Möglichkeiten der Probenbeschriftung sowie die kontinuierliche Verbesserung der optischen Elemente durch die Mikroskophersteller ebneten den Weg für die Entwicklung neuer bildgebender Verfahren, die wiederum für rasante Fortschritte in bestimmten Forschungsbereichen sorgen. Dies gilt insbesondere für die Zell- und die Molekularbiologie sowie für die Neurowissenschaften, wo konfokale Mikroskope häufig in Kombination mit Fluoreszenztechniken eingesetzt werden.

In Abbildung 1 ist ein Hochleistungsobjektiv dargestellt, das speziell für die Verwendung mit Laserbeleuchtung vom violetten bis zum nahen Infrarotbereich des Spektrums entwickelt wurde. Bei dem Objektiv handelt es sich um ein apochromatisches 60X-Flatfield-Ölimmersionsmodell, das für den Wellenlängenbereich von 405 bis 1.000 Nanometer korrigiert ist. Eine besonders nützliche Funktion des Objektivs ist die Möglichkeit, gleichzeitig Fluoreszenz- und differentielle Interferenzkontrast (DIC)-Untersuchungen durchzuführen.

Generell müssen Objektive in konfokalen Geräten ähnliche Anforderungen erfüllen wie auch in anderen kritischen Mikroskopieanwendungen. Neue Techniken führen jedoch dazu, dass diese Linsensysteme häufiger denn je an ihre Leistungsgrenzen stoßen. Hinzu kommen anwendungsspezifische Beschränkungen, durch die bestimmte Eigenschaften der Objektive in den Vordergrund rücken können. Die Hersteller reagieren darauf mit der Entwicklung neuer Optiken, die optimal auf die Anforderungen der jeweiligen Verfahren ausgerichtet sind. Ein Beispiel dafür sind neue hochkorrigierte Silikonölimmersionsobjektive mit einer hohen numerischen Apertur als Reaktion auf die Zunahme der Forschung mit lebenden Zellen und Geweben, die zwangsläufig in wässrigem Medium durchgeführt werden. Entsprechend ist denkbar, dass spezielle Anforderungen in der konfokalen Mikroskopie zur Entwicklung von Optiken führen werden, die eine oder mehrere der auflösungsbeschränkenden Aberrationen vielleicht weniger streng korrigieren, dafür aber für die konfokale Mikroskopie wichtigere Eigenschaften aufweisen.

Die Auflösung von Laser-Scanning-Mikroskopen

Die Auflösung in optischen Systemen gilt gemeinhin als der Mindestabstand zwischen zwei Probenmerkmalen, der es ermöglicht, diese Merkmale im endgültigen Bild voneinander zu unterscheiden. Ausgehend von einem bestimmten, für die visuelle Erkennung erforderlichen Kontrast kann die Auflösung als Funktion der Lichtwellenlänge (λ) und der numerischen Apertur (NA) des optischen Systems angegeben werden. Die Interferenz zwischen den durch die Objektivblende gebeugten Wellen erzeugt die Intensitätsverteilung der Airy-Scheibchen (oder Beugungsscheibchen) in der Bildebene, deren Durchmesser (d) im idealen beugungsbegrenzten System durch die folgende Gleichung gegeben ist:

d_Airy= 1,22 • λ/NA

Nach dem Rayleigh-Kriterium lassen sich zwei Punkte nur dann sicher unterscheiden, wenn sie mindestens um die Hälfte des Durchmessers des Airy-Scheibchens auseinander liegen. Folglich ist der Airy-Radius (r) gleichbedeutend mit der lateralen Auflösung und wird durch Abwandlung der vorangegangenen Gleichung definiert. In einer Epifluoreszenz-Konfiguration fungiert das Objektiv zusätzlich auch als Kondensor, so dass im folgenden Ausdruck NA für die numerische Apertur des Objektivs steht:

r_Airy= 1,22 • λ/(2 • NA)

Beugungsbegrenzungen, die zu einer lateralen Umverteilung der Intensität von Punktobjekten in Airy-Muster führen, bewirken auch eine Defokussierung entlang der optischen Achse, wodurch sich die Größe und Form des Bildpunkts ändern. Die dreidimensionale Intensitätspunktspreizfunktion beschreibt die Intensitätsverteilung und stellt die Leistung des optischen Systems bei der Übertragung von Probeninformationen auf die Bildebene dar. Bei refraktiven Linsensystemen treten charakteristische optische Aberrationen auf, die, wenn sie nicht durch die Objektivkonstruktion korrigiert oder durch eine andere optische Komponente ausgeglichen werden, die Intensitätsverteilung der Probenpunkte im Bild verändern und das Bild im Vergleich zur idealen beugungsbegrenzten Leistung verschlechtern. Demzufolge müssen bei der Auswahl der Objektive für konfokale Anwendungen die Auswirkungen der potenziellen Aberrationen berücksichtigt werden. In den folgenden Abschnitten werden die Faktoren der Objektivkonstruktion und -leistung erörtert, die speziell für das konfokale Mikroskop von Bedeutung sind.

Bei der am weitesten verbreiteten konfokalen Mikroskopkonfiguration für biologische Anwendungen wird ein computergesteuertes Scanning-System verwendet, das einen durch das Objektiv fokussierten Laserstrahl über eine stationäre Probe ablenkt. Dies wird als achsenfernes konfokales Scanning-System bezeichnet, da der abgetastete Strahl zu beiden Seiten der optischen Achse abgelenkt wird und die peripheren Bereiche der Objektivelemente nutzt. Die ersten Scanning-Mikroskope wiesen eine achsennahe Konstruktion auf, bei der der Laserstrahl auf der optischen Achse fixiert blieb und der Probentisch oder das Objekt abgetastet wurde.

Prinzipiell führen beide Verfahren zu ähnlichen Ergebnissen. Die Anforderungen an die Auswahl eines Objektivs mit optimaler Leistung sind für das Scannen mit achsennahen und achsenfernen Lichtstrahlen jedoch völlig verschieden. Auch unterscheiden sich die Methoden, wie die emittierte Fluoreszenz vom Objektiv erfasst wird. Bei einem dritten Scannertyp wird die Probe mit Lichtpunkten abgetastet, die durch Öffnungen in einer sich drehenden Nipkow-Scheibe auf die Probe fallen, wobei Objekttisch und Lichtquelle sich nicht bewegen. Nipkow-Systeme sind bei Untersuchungen an lebenden Zellen sehr beliebt, da sie im Vergleich zu Konfigurationen, die abgetastete Laserquellen mit hoher Intensität verwenden, die Schädigung der Zellen minimieren.

Linsenaberrationen, die sich auf die Leistung des Objektivs auswirken, können in zwei Kategorien unterteilt werden: in nicht-chromatische (wellenlängenunabhängige) und chromatische (wellenlängenabhängige) Aberrationen. Bei den chromatischen Aberrationen handelt es sich entweder um laterale chromatische Aberrationen oder longitudinale chromatische Aberrationen; zu den wellenlängenunabhängigen Aberrationen gehören sphärische Aberrationen, Koma, Astigmatismus, Bildfeldwölbung und Verzeichnungen. Chromatische Aberrationen und sphärische Aberrationen wirken sich auf das gesamte Bildfeld aus, während die übrigen Aberrationen eher in achsenfernen Bereichen auftreten. Die chromatischen und sphärischen Aberrationen (siehe Abbildung 2) beeinträchtigen vor allem die konfokale Leistung. In der Regel lassen sich chromatische Aberrationen nicht durch verfahrenstechnische Änderungen eliminieren, sondern müssen durch die Konstruktion der optischen Komponenten ausgeglichen werden. Andere Artefakte, insbesondere die sphärische Aberration, werden meist durch eine unsachgemäße Verwendung des Objektivs oder durch den Einsatz unpassender optischer Komponenten verstärkt, können aber durch die Anwendung geeigneter Techniken oder durch Anpassungen des optischen Systems minimiert oder kompensiert werden.

Sphärische Aberration

Die sphärische Aberration ist die nicht-chromatische Aberration mit der größten Auswirkung auf die konfokale Leistung. Sie tritt bei sphärischen Linsenkomponenten auf und bewirkt, dass paraxiale und periphere Lichtstrahlen in aufeinanderfolgenden Ebenen fokussiert werden. Ein unterschiedlicher Brechungsgrad bei Strahlengängen durch verschiedene Linsenbereiche führt zu einer Unschärfe des fokussierten Bildes einer Punktquelle und erzeugt eine asymmetrische Intensitätsänderung oberhalb und unterhalb der Fokusebene. Bei allen modernen Objektiven wird die sphärische Aberration so weit korrigiert, dass sie visuell nicht mehr wahrnehmbar ist, wenn die vorgegebenen Funktionsvariablen für die Objektivkonstruktion genau eingehalten werden. Leider gibt es in der Praxis mehrere Möglichkeiten, von den optischen Konstruktionskriterien des Objektivs abzuweichen und eine sphärische Aberration zu verursachen. Beispielsweise könnte das Artefakt ungewollt eingeführt werden, wenn die für das Objektiv angegebene Tubuslänge nicht eingehalten wird, da die sphärische Aberration nur bei einem genau festgelegten Abstandsverhältnis zwischen dem Objektiv und der Proben- und Bildebene angemessen korrigiert werden kann. Dies könnte der Fall sein, wenn das Objektiv an einem Mikroskop mit einer anderen als der erforderlichen Tubuslänge in einem feinkorrigierten System verwendet wird oder wenn optische Elemente wie Filter in den konvergierenden Strahlengang eines solchen Systems eingeführt werden.

Die optimale Korrektur der sphärischen Aberration erfordert eine sorgfältige Berücksichtigung der Bildgebungsmedien außerhalb des Objektivs, was eine weitere potenzielle Quelle für Leistungseinbußen darstellen kann. Die Objektiveigenschaften sind durch die Konstruktion festgelegt und können nicht an unterschiedliche Betriebsbedingungen angepasst werden (mit Ausnahme der Anpassungen mit Korrekturringen). Zu den Faktoren, die zu einer starken sphärischen Aberration führen können, gehören minderwertiges Immersionsöl zwischen Objektiv und Probe, eine nicht normgerechte Deckglasdicke, das Eindeckmedium der Probe und die Probe selbst. Jedes Material, das zwischen die Probe und die vordere Linse des Objektivs gelangt, wird zu einer kritischen Komponente des Bildgebungssystems. Die Einhaltung der Konstruktionsanforderungen des Objektivs wird bei höherer numerischer Apertur noch kritischer. Schwankungen in der Deckglasdicke oder im Brechungsindex können die sphärische Aberration erhöhen, insbesondere bei Trockenobjektiven (ohne Immersion). Trockenobjektive mit hoher numerischer Apertur sind in der Regel für eine optimale Leistung mit einem Deckglas von 0,17 Millimeter Dicke ausgelegt, wobei die Probe direkt darunter und in Kontakt mit dem Glas platziert wird.

Zur Korrektur der sphärischen Aberration bei Verwendung von nicht genormten Deckgläsern sind viele Objektive mit einem Korrekturring ausgestattet, der auf verschiedene Stärken eingestellt werden kann. Der Korrekturring dient dazu, eine interne Linsengruppe zu verschieben, um die Brennweite des Objektivs zu verändern. Selbst wenn ein Deckglas mit der richtigen Dicke verwendet wird, führt die Verwendung eines Eindeckmediums zwischen Glas und Probe zur Abweichung von der idealen optischen Konstellation und zu erhöhter sphärischer Aberration. Der Korrekturring kann auch verwendet werden, um die sphärische Aberration zu minimieren, die durch Brechungsindexänderungen verursacht wird und die in der konfokalen Mikroskopie zu einer Verringerung der Intensität an der Lochblende und zu einer Verringerung der Tiefenunterscheidung aufgrund von axialen Fokusverschiebungen führt.

Ölimmersionsobjektive sind in der Regel für die Verwendung mit einem 0,17 Millimeter dicken Deckglas mit einem Brechungsindex von 1,518 bei bestimmten Wellenlängen und einem Immersionsöl mit genau definiertem Brechungsindex optimiert. Durch Festlegung der Betriebsbedingungen in Bezug auf das Deckglas und das Immersionsmedium kann die sphärische Aberration durch die Objektivkonstruktion für mehrere Wellenlängenbereiche (je nach Objektivtyp) korrigiert werden. Die Abstimmung der Brechungsindizes zwischen den einzelnen Materialien im gesamten Lichtweg von der Probe und dem Eindeckmedium bis zur vorderen Linse des Objektivs war in der Vergangenheit eines der problematischsten Bildgebungskriterien, insbesondere wenn versucht wurde, eine hohe Auflösung bei biologischen Proben zu erzielen. Der Brechungsindex der subzellulären Komponenten ist wesentlich niedriger als der von herkömmlichen Immersionsmedien, und in vielen Fällen sind diese Brechungsindizes unsicher und variieren in der gesamten Probe. Selbst bei festen Materialien ist der Brechungsindex des Eindeckmediums in der Regel nicht identisch mit dem der verfügbaren Immersionsöle.

Bei der Untersuchung von dynamischen Prozessen in lebenden Zellen, die in physiologischer Kochsalzlösung kultiviert und gehalten werden, führt die Diskrepanz zwischen den Brechungsindizes von Öl und Wasser zu einer kritischen Einschränkung der Leistung von Ölimmersionsobjektiven. Das liegt vor allem daran, dass das volle Potenzial der Ölimmersionsobjektive mit der höchsten numerischen Apertur aufgrund der Diskrepanz zwischen dem Brechungsindex von Wasser (1,33) und dem von Immersionsöl (etwa 1,5) nicht ausgeschöpft wird. Die konfokale Mikroskopie zeichnet sich vor allem durch eine verbesserte Fluoreszenzbildgebung und die dreidimensionale Darstellung dicker Proben aus. Die sphärische Aberration, die bei der Verwendung von Ölimmersionsobjektiven mit wässrigen Proben auftritt, begrenzt jedoch die Tiefe, in der akzeptable Bilder erzielt werden können. Im Allgemeinen sind Ölimmersionsobjektive mit hoher numerischer Apertur für Bildebenen bis maximal 15 bis 20 Mikrometer unter dem Deckglas ausgelegt. Bei wässrigen Proben kann die sphärische Aberration, die an der Grenzfläche zwischen Wasser und Deckglas entsteht, jedoch schon bei einer Tiefe von 10 Mikrometern beträchtliche Werte erreichen. Die in Abbildung 3 dargestellten Punktspreizfunktionen zeigen beispielsweise den zunehmenden Grad der sphärischen Aberration bei einem Plan-Apochromat-Ölimmersionsobjektiv in Eindringtiefen von 0 bis 8 Mikrometern.

Das Interesse an der Nutzung konfokaler Fluoreszenztechniken zur Erfassung dreidimensionaler Daten von wässrigen biologischen Proben war für Mikroskophersteller ein Hauptanreiz, eine Reihe von hochkorrigierten Wasserimmersionsobjektiven mit hoher numerischer Apertur einzuführen. Wasser hat jedoch zwei Nachteile: Es trocknet leicht ein und eignet sich daher nicht für Langzeitaufnahmen im Zeitraffer. Aufgrund seines niedrigen Brechungsindex von 1,33 ist es außerdem bei Objektiven mit hoher numerischer Apertur ungeeignet. Daher wurden Silikonölimmersionsobjektive entwickelt, deren Brechungsindex von 1,4 dem von lebenden Zellen nahekommt. Außerdem trocknet Silikonöl nicht ein. Die sphärische Aberration ist eine wesentliche optische Einschränkung bei konfokalen Untersuchungen lebender Zellen, wenn Ölimmersionsobjektive verwendet werden, und die Auswirkungen nehmen proportional zur Beobachtungstiefe in wässrigem Medium und variablen subzellulären Komponenten zu (siehe Abbildung 3). Zu den negativen Auswirkungen auf die Bildgebung gehören der Verlust von Kontrast und Signalintensität aufgrund einer Verringerung des Anteils der emittierten Fluoreszenzintensität, der die Lochblende des Detektors erreicht, der Verlust der Auflösung kleinster Probenmerkmale und die Verringerung der Positionsgenauigkeit der z-Achse, was die Integrität dreidimensionaler Bildrekonstruktionen beeinträchtigt. Durch die Verwendung von Silikonölimmersionsobjektiven bei der Bildgebung sehr tiefer Schichten von Proben in wässrigem Medium unter dem Deckglas kann die sphärische Aberration vermieden oder minimiert werden, so dass die Vorteile des konfokalen Verfahrens voll zum Tragen kommen. Silikonölimmersionsobjektive mit langen Arbeitsabständen können in wässrigem Medium genaue dreidimensionale Daten in Tiefen von mehr als 200 Mikrometern erfassen.

Ein solches Ölimmersionsobjektiv ist jedoch unabhängig vom Grad der optischen Korrektur nicht die optimale Wahl für die Bildgebung einer Probe mit Wasserimmersion. Eine optimale Bildqualität ist mit dieser Kombination nur für Probenbereiche möglich, die in direktem Kontakt mit dem Deckglas stehen. In größerer Tiefe verschlechtern die Auswirkungen der sphärischen Aberration den Kontrast und die Auflösung und verringern die Bildhelligkeit so stark, dass das konfokale Signal-Rausch-Verhältnis drastisch sinkt. Die optimale Lösung zur Minimierung der induzierten sphärischen Aberration bei der Bildgebung aus großer Distanz in wässrigem Medium ist die Verwendung eines hochkorrigierten Silikonölimmersionsobjektivs.

Eine Möglichkeit zur Korrektur der sphärischen Aberration ist der Einsatz von Korrekturringen an Wasser- und Silikonölimmersionsobjektiven. Diese Einstellringe ermöglichen eine variable Korrektur der sphärischen Aberration, die z. B. durch Schwankungen der Deckglasdicke verursacht wird. Diese Korrekturringe sind auch nützlich, um Brechungsindexunterschiede in physiologischem Medium und in Zell- und Gewebebestandteilen sowie Schwankungen des Brechungsindexes bei Änderungen der Temperatur oder der Konzentration gelöster Stoffe auszugleichen. Wegen der Vielzahl von Faktoren, die zur induzierten sphärischen Aberration beitragen können, ist eine einstellbare Korrektur ein wünschenswertes Merkmal eines Objektivs für konfokale Anwendungen, auch dann, wenn Deckgläser mit optimaler Dicke verwendet werden.

Achsenferne optische Aberrationen

Die Koma ist ein häufiger optischer Abbildungsfehler und wirkt sich in erster Linie auf punktförmige Quellen abseits der optischen Achse aus, indem eine kometenschweifartige radiale Verzerrung der Bildpunkte erzeugt wird, die mit dem Bildwinkel zunimmt (siehe Abbildung 4). Die Koma ist der sphärischen Aberration insofern ähnlich, als beide potenziell durch dieselben Faktoren verursacht werden. Diese Aberration wird in modernen optischen Systemen durch den Einsatz geeigneter Linsenelemente im Allgemeinen gut korrigiert. Objektive, bei denen Koma und sphärische Aberration eliminiert sind, werden als aplanatisch bezeichnet. Da die Koma in erster Linie eine achsenferne Aberration ist, ist sie für konfokale Laser-Scanning-Systeme mit ihren in der Regel achsenfernen Strahlengängen von Bedeutung, wohingegen sie bei (achsennahen) konfokalen Mikroskopen mit Probenabtastung keine Rolle spielt.

Es gibt weitere geometrische Aberrationen, die für die Leistung konfokaler Objektive potenziell von Bedeutung sind. Da sie alle in den vom Zentrum entfernten Bereichen des Bildfeldes deutlicher zu erkennen sind, beeinträchtigen sie die Leistung von konfokalen Laser-Scanning-Systemen wahrscheinlich stärker. Die optischen Anforderungen der konfokalen Bildgebung sind so hoch, dass nur hochkorrigierte Optiken eine adäquate Leistung erbringen können. In der Regel sind bei Objektiven dieser Kategorie dann auch signifikante geometrische Aberrationen minimiert. Es ist jedoch von Vorteil, sich dieser Aberrationen und der potenziellen Probleme bewusst zu sein, die durch die Wahl der Objektive entstehen können. Dies gilt insbesondere dann, wenn bestimmte Leistungsmerkmale geopfert werden, um eine andere Variable zu optimieren, die in einer bestimmten Anwendung wichtiger sein könnte.

Ein unkorrigierter Astigmatismus kann die Bildintensität, die Schärfe und den Kontrast verringern, wobei sich die Auswirkungen mit zunehmender Entfernung von der optischen Achse verstärken (Abbildung 4). Die Geometrie eines astigmatischen Bildpunktes kann durch die Betrachtung zweier orthogonaler Ebenen definiert werden, die Querschnitte durch die Wellenfront des Bildes darstellen. Die Tangential- und die Sagittalebene in einem astigmatischen System können unterschiedliche Brennweiten und Radien für einen perfekt symmetrischen Probenpunkt aufweisen. Diese Aberration führt dazu, dass symmetrische punktförmige Merkmale, die sich außerhalb der Achse befinden, je nach Fokus entweder radial oder tangential in der Bildebene verlängert werden. Wenn der beste Fokus in einer Kompromissposition zwischen den beiden Extremen gewählt wird, ist das resultierende Airy-Scheibchen unsymmetrisch, was zu einer Bildverschlechterung führt. Astigmatismus kann durch schlecht zentrierte Elemente in einem minderwertigen oder beschädigten Objektiv entstehen und wird durch andere Fehlausrichtungen im optischen Pfad des Mikroskops verstärkt.

Die Bildfeldwölbung ist eine weitere Eigenschaft von Objektiven, welche die konfokale Bildgebung bei der Abbildung eines größeren Sichtfeldes, insbesondere von Gewebeschnitten, beeinträchtigen kann. Einfache sphärische Linsen fokussieren Bildpunkte aus verschiedenen Regionen einer ebenen Probe auf eine gekrümmte Bildfläche, die die Form der Linsenoberfläche widerspiegelt. Eine flache Bildebene entspricht nicht der gekrümmten Fokusebene, so dass zentrale und periphere Bereiche des Bildes nicht gleichzeitig scharf abgebildet werden können. Um diese Bildfeldwölbung zu korrigieren und den scharfen zentralen Bereich zu vergrößern, sind komplexere Linsenkonstruktionen erforderlich, die aus mehreren Gruppen von Linsen bestehen. Objektive mit der Bezeichnung Flatfield oder Plan sind optisch so korrigiert, dass sie in der Zwischenbildebene ein breites Feld erzeugen, das von der Mitte bis zum Rand scharf ist und nur eine minimale Bildfeldwölbung aufweist. Die Planität in der endgültigen Bildebene hängt auch von den optischen Zwischenelementen, beispielsweisen den Mikroskopokularen, ab.

Die Nichtlinearität der Vergrößerung von der Mitte bis zu den Rändern des Bildfelds führt zu geometrischen Verzeichnungen der Probenmerkmale, wodurch deren tatsächliche Dimensionsprofile im Bild verzerrt werden. Dieser Effekt lässt sich besonders gut erkennen, wenn mehrere sich senkrecht kreuzende Linien abgebildet werden. Anstatt über das gesamte Bildfeld hinweg gerade zu erscheinen, sind die Linien in Bereichen, die nicht in der Mitte des Feldes liegen, entweder nach außen oder nach innen gekrümmt. Diese beiden Arten der Verzeichnung werden meist als Tonnenverzeichnung bzw. Kissenverzeichnung bezeichnet. Wie Bildfeldwölbungen sind auch geometrische Verzeichnungen bei biologischen Anwendungen im Allgemeinen bis zu einem bestimmten Grad nicht von großer Bedeutung, können aber bei materialwissenschaftlichen Untersuchungen entscheidend sein, wenn Defektanalysen oder präzise Messungen beabsichtigt sind.

Chromatische Aberrationen

Chromatische Aberrationen werden durch zwei grundlegende optische Phänomene verursacht, die wellenlängenabhängig sind und unterschiedliche Arten von Bildfehlern hervorrufen. Die eine Art der chromatischen Aberration wird dadurch verursacht, dass sich die Brechungsindizes aller optischen Gläser mit der Wellenlänge ändern, während die zweite durch die wellenlängenabhängige Änderung der Vergrößerung entsteht. Die Abhängigkeit des Brechungsindexes von der Wellenlänge (üblicherweise als Dispersion bezeichnet) führt zu einer effektiven Brennweitendifferenz für Licht unterschiedlicher Wellenlänge. Folglich kann bei einem einfachen Objektiv mit nur einem Glas nur eine Wellenlänge (oder ein schmaler Wellenlängenbereich) mit einer bestimmten Fokuseinstellung präzise auf die Bildebene fokussiert werden. Andere Wellenlängen werden entweder näher oder weiter weg vom Objektiv fokussiert. Die daraus resultierende spektrale Dispersion entlang der optischen Achse wird als longitudinale chromatische Aberration oder alternativ als axiale chromatische Aberration bezeichnet (siehe Abbildung 5). Bei einer punktförmigen Quelle, die auf der optischen Achse abgebildet wird, führt die Abstufung der Brechungsindizes dazu, dass blaues Licht in der Nähe des Objektivs gebündelt wird, während längere Wellenlängen in Fokuspunkten konvergieren, die zunehmend weiter vom Objektiv entfernt sind. Wird die Aberration nicht korrigiert, ist sie in Form von unterschiedlichen Farbsäumen sichtbar, wenn das Bild zu beiden Seiten des besten visuellen Fokus defokussiert wird.

Eine unkorrigierte longitudinale chromatische Aberration in einem Objektiv, das für die konfokale Mikroskopie verwendet wird, kann große Auswirkungen haben, insbesondere bei der Abbildung von zwei oder mehr Fluorophoren, für die eine Kolokalisierung der Fluoreszenzemission bei verschiedenen Wellenlängen nachgewiesen werden muss. Wenn mehrere Fluorophore verwendet werden, führt die longitudinale chromatische Aberration dazu, dass die verschiedenen Laseranregungsstrahlen auf unterschiedliche Punkte in der Probe fokussiert werden, so dass die verschiedenen Emissionswellenlängen von nicht zusammenfallenden Punkten erfasst werden. Diese Aberration macht es unmöglich, die genauen Positionen der Fluorophore in z-Richtung zu bestimmen, um die Probendaten dreidimensional darzustellen.

Bei konfokalen Scanning-Verfahren müssen für die Bewertung der Auswirkungen chromatischer Aberrationen auf die Integrität der Bilder für ein bestimmtes Objektiv alle Faktoren berücksichtigt werden, die die Signalenergie bestimmen, welche durch die Lochblende hindurchgeht und vom Detektor aufgezeichnet wird. Zu diesen Faktoren gehören das Emissionsspektrum des Anregungslasers, der Emissionspeak und die Bandbreite der einzelnen Fluorophore sowie die spektrale Empfindlichkeit des Detektors. Die Korrektur der longitudinalen chromatischen Aberration wird bei der Objektivkonstruktion in der Regel durch die Kombination mehrerer Linsenelemente mit unterschiedlichen optischen Eigenschaften erreicht. Der Grad der Korrektur ist Teil der Grundlage für die Einstufung von Objektiven in verschiedene Kategorien (wie unten erläutert).

Die wellenlängenabhängige Änderung der Linsenbrennweite, die die für die longitudinale chromatische Aberration charakteristische axiale Dispersion erzeugt, ist auch für das Auftreten der lateralen chromatischen Aberration verantwortlich (siehe Abbildung 5). Da sich die Vergrößerung umgekehrt proportional zur Brennweite verhält, ergibt sich aus der wellenlängenabhängigen Änderung der Brennweite eine entsprechende Abhängigkeit der Vergrößerung von der Wellenlänge. Wenn diese Aberration im Objektiv nicht korrigiert wird, können scharfe Kanten im Bild von roten oder blauen Farbsäumen umgeben sein. Die Vergrößerung der blauen Wellenlängenkomponente des Signals kann bei unkorrigierten Objektiven um etwa 1 bis 2 Prozent von der der roten Komponente abweichen. In einem konfokalen Scanning-System kann die laterale chromatische Aberration zu einem Signalverlust an der Lochblende führen, da das emittierte Licht je nach der spektralen Zusammensetzung des Lichts an einer Stelle abgebildet wird, die entweder näher an der optischen Achse liegt oder weiter von ihr entfernt ist als die tatsächliche Position der Probe.

Da die beiden Arten der chromatischen Aberration miteinander zusammenhängen, weisen Objektive, die in hohem Maße für die longitudinale chromatische Aberration korrigiert sind, in der Regel auch nur eine minimale laterale chromatische Aberration auf. Die Mikroskophersteller gehen bei der Korrektur der verschiedenen Faktoren, die die optische Leistung beeinflussen, unterschiedlich vor. Unerlässlich ist jedoch eine sorgfältige Abstimmung der Systemkomponenten, um die Aberrationen maximal zu korrigieren. In der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie führt eine unkorrigierte laterale chromatische Aberration zu ähnlichen Problemen wie die longitudinale Aberration, da Fehler bei der Abbildung der Positionen von Fluorophoren, die bei unterschiedlichen Wellenlängen emittieren, auftreten.

Bisher wurde bei der Herstellung optischer Mikroskope meist ein Standard für die Objektivkonstruktion befolgt, bei dem das Objektiv ein reales Bild in einem bestimmten festen Abstand von der Montagefläche des Objektivs erzeugen muss, der der vorderen Brennebene des Okulars entspricht. Konfigurationen, die auf der direkten Erzeugung eines echten Zwischenbildes durch das Objektiv beruhen, werden als endliche Systeme bezeichnet. Der Abstand zum Zwischenbild ist die Tubuslänge des Objektivs. Obwohl die verschiedenen Hersteller ihre endlichen optischen Systeme auf die gleiche Tubuslänge und den gleichen parfokalen Abstand standardisiert haben, wurden unterschiedliche Ansätze zur Kompensation von Linsenfehlern angewandt. Dies muss berücksichtigt werden, wenn optische Komponenten verschiedener Hersteller kombiniert werden. Endliche Systeme können so konstruiert sein, dass sie eine vollständige Aberrationskorrektur im Objektiv bieten. Es ist auch möglich, dass in dem vom Objektiv erzeugten Bild eine gewisse laterale chromatische Aberration zugelassen und durch das Okular kompensiert wird.

Bei unendlichen optischen Systemen werden die Lichtstrahlen, die das Objektiv verlassen, nicht fokussiert, sondern bleiben parallel, bis sie in der Zwischenbildebene durch eine Tubuslinse (gelegentlich auch als Telan-Linse bezeichnet) konvergiert werden. Die meisten großen Mikroskophersteller haben unendlich korrigierte optische Systeme entwickelt, die den Vorteil haben, dass die Lichtstrahlen des unendlich fokussierten Objektivs relativ unempfindlich gegenüber zusätzlichen optischen Komponenten sind, die sich im „Unendlichkeitsraum“ zwischen Objektiv und Tubuslinse befinden. Obwohl die Tubuslinse eine gewisse Korrektur der Restaberrationen ermöglicht, bieten Konstruktionen mit vollständiger Korrektur innerhalb des Objektivs Vorteile in Bezug auf ihre Vielseitigkeit, da die Tubuslinse optisch neutral ist. In Abbildung 6 sind die unendlichen Lichtwege für typische aufrechte und inverse Fluoreszenzmikroskope dargestellt. Der weiße Doppelpfeil in jedem Mikroskopdiagramm zeigt den parallelen Strahlengang zwischen der hinteren Objektivöffnung und der Tubuslinse an.

Die verschiedenen Hersteller halten sich bei ihren Unendlichkeitssystemen an unterschiedliche Konstruktionsspezifikationen, zum Beispiel in Bezug auf die Brennweite der Tubuslinse und die Länge des Unendlichkeitsraums. Bei unendlich korrigierten optischen Systemen kann zur Fokussierung das Objektiv anstelle des Mikroskoptisches bewegt werden, was bei Anwendungen, die eine feinfühlige Manipulation der Probe während der Beobachtung erfordern, einen deutlichen Vorteil darstellt. Der wichtigste praktische Vorteil des Unendlichkeitsraums besteht jedoch darin, dass optische Zusatzkomponenten wie Analysatoren für polarisiertes Licht, Filter und Prismen mit differentiellem Interferenzkontrast (DIC) hinzugefügt werden können, ohne dass deren Brechungseigenschaften oder Dicke eine Rolle spielen. Solange sie planparallele Oberflächen haben, wirken sich die zusätzlichen Elemente nur geringfügig auf die Bildqualität aus. Im Gegensatz dazu können optische Komponenten nicht in den Strahlengang eines endlich korrigierten Systems eingebracht werden, der zwischen Objektiv und Zwischenbildebene konvergiert, ohne dass es zu Bildverschiebungen und anderen Aberrationen kommt, die mit der Dicke und dem Brechungsindex der hinzugefügten Elemente variieren.

Optische Korrektur in Mikroskop-Objektiven

Unabhängig davon, ob ein endlich oder unendlich korrigiertes optisches System verwendet wird, müssen die Leistungskriterien der für das System konzipierten Objektive in ihrer Gesamtheit berücksichtigt werden, um zu bestimmen, welche Objektive den Anforderungen einer bestimmten Abbildungsmethode entsprechen. Objektive werden in der Regel nach dem Grad ihrer optischen Korrektur in Leistungsklassen eingeteilt. Wie bereits erwähnt, hängt die relative Bedeutung der verschiedenen Aberrationen und der von ihnen beeinflussten Leistungskriterien von der Anwendung des Objektivs und von den wesentlichen Anforderungen der jeweiligen Anwendung ab. Die allgemeinste Klassifizierung der Objektive basiert in der Regel auf dem Grad der Korrektur der chromatischen Aberration, wenngleich die bisherigen Objektivkategorien aufgrund signifikanter technologischer Fortschritte in der Konstruktion und Herstellung von Optiken nicht mehr klar voneinander zu trennen sind. Die meisten Kategorien sind jedoch nach wie vor gültig und in der Praxis weit verbreitet. Deshalb empfiehlt es sich, die verwendeten Begriffe und ihre Bedeutung für konfokale Anwendungen zu kennen, um das richtige Objektiv für die jeweilige Anwendung auszuwählen.

Chromatische Aberrationen sind eine Folge der Dispersion im optischen Glas, das zur Herstellung eines Objektivs verwendet wird, und werden in der Regel durch eine Kombination von Linsenelementen mit unterschiedlichen Dispersionseigenschaften korrigiert. Traditionell werden Objektive, die eine minimale Korrektur der chromatischen Aberration aufweisen, als Achromate (siehe Abbildung 7) eingestuft und in der Regel aus Glas mit „normaler“ Dispersion hergestellt. Diese Art von Glas, zu der beispielsweise Kron- und Flintglas gehören, zeichnet sich durch eine nahezu lineare Abnahme des Brechungsindex mit zunehmender Wellenlänge aus. Kronglas weist in der Regel einen niedrigen Brechungsindex und eine geringe Dispersion auf, Flintglas dagegen einen hohen Brechungsindex und eine hohe Dispersion. In älteren achromatischen Objektiven wurden zwei oder mehr Linsenelemente dieser Glastypen kombiniert, um die chromatische Aberration zu korrigieren und rotes und blaues Licht auf einen gemeinsamen Brennpunkt zu bringen. Gleichzeitig wird die sphärische Aberration für grünes Licht korrigiert. Moderne Achromate verfügen in der Regel über eine zusätzliche Korrektur der sphärischen Aberration und eine signifikante Korrektur der Bildfeldwölbung. Wenn das Objektiv so korrigiert ist, dass sich die Planität über das gesamte Bildfeld erstreckt, handelt es sich um einen sogenannten Plan-Achromat. Im Allgemeinen eignen sich achromatische Objektive für die herkömmliche visuelle Hellfeldmikroskopie sowie für die Mikrofotografie und die digitale Bildgebung mit zusätzlicher Korrektur der Bildfeldwölbung (Plan).

Damit das Objektiv eine bessere Korrektur der chromatischen Aberration erreicht, sind Glastypen erforderlich, die über einen Teil des Spektrums eine anormale Dispersion aufweisen. Bei Gläsern, die eine nichtlineare Änderung des Brechungsindex mit der Wellenlänge im roten oder blauen Spektralbereich aufweisen, können die chromatischen Aberrationen ausgeglichen werden, um die gleichzeitige Fokussierung von mehr als zwei Wellenlängen zu ermöglichen. Kristalliner Fluorit war eines der ersten Materialien mit geeigneten optischen Eigenschaften, um das unkorrigierte sekundäre Spektrum zu reduzieren, das für die für Bilder mit Achromaten charakteristischen grünen oder violetten Streifen an scharfen Kanten verantwortlich ist. In Kombination mit verschiedenen optischen Gläsern bieten Fluoritelemente die Möglichkeit, chromatische Linsenfehler für drei Wellenlängen (Farben) und sphärische Aberrationen für zwei Wellenlängen zu korrigieren. Darüber hinaus haben solche hochkorrigierten Objektive verbesserte Übertragungseigenschaften im ultravioletten Spektralbereich.

Neuere technologische Entwicklungen haben zu neuen optischen Glasrezepturen und Linsenformungsmöglichkeiten geführt, die ähnliche Dispersionseigenschaften wie Fluoritelemente aufweisen. Die meisten Hersteller bieten eine Reihe von Fluor-Objektiven mit optischen Korrekturen nahezu der höchsten Kategorie an (Abbildung 7). Diese Objektive werden manchmal als Semi-Apochromate bezeichnet und können Fluoritelemente enthalten oder auch nicht. Aufgrund ihrer optischen Eigenschaften werden sie auch als Fl und PlanFl bezeichnet. Die aktuellen Objektive dieser Kategorie sind in vielen Konfigurationen erhältlich, darunter auch als Modelle für die Verwendung mit mehreren Immersionsmedien. Sie eignen sich für Hellfeld-, Fluoreszenz-, Phasenkontrast-, Polarisations- und Differentialinterferenzkontrastanwendungen sowie für einige konfokale und Multiphotonen-Anwendungen.

Objektive, die als Apochromate klassifiziert sind, weisen im Allgemeinen den höchsten Grad an Korrektur für chromatische und sphärische Aberrationen auf (siehe Abbildung 7). Diese Objektive haben in der Regel die höchste numerische Apertur für eine bestimmte Vergrößerung. Hier werden sowohl chromatische als auch sphärische Aberrationen für mindestens drei Wellenlängen korrigiert. Durch die nahezu vollständige Korrektur der Aberrationen sind Apochromate im Allgemeinen für alle Mikroskopietechniken geeignet, wobei jedoch alle spezifischen Leistungsanforderungen der jeweiligen Technik berücksichtigt werden müssen. Trotz ihrer außergewöhnlichen optischen Korrektur müssen bei Apochromaten aufgrund der Verwendung von Triplet- oder Doublet-Linsenelementen manchmal Abstriche bei anderen wichtigen Eigenschaften wie der numerischen Apertur oder Planität in Kauf genommen werden. Neuere kommerzielle Verfahren ermöglichen dank neuartiger Linsenpoliertechnologien die Herstellung ultradünner Linsenelemente, sodass dieser Kompromiss der Vergangenheit angehört. Durch die Kombination von ultradünnen konvexen und konkaven Linsen erreichen diese Objektive eine Korrektur der chromatischen Aberration und eine höhere Durchlässigkeit im Spektralbereich von Violett bis NIR, eine höhere numerische Apertur und eine erweiterte Planität.

Konfokale Fluoreszenzanwendungen können stark eingeschränkt sein, wenn die Objektivaberrationen für die Anregungs- und die Emissionswellenlängen nicht in gleicher Weise korrigiert werden. Diese Anforderung ist noch schwieriger zu erfüllen, wenn mehrere Fluorophore verwendet werden oder wenn der Unterschied zwischen Anregungs- und Emissionswellenlängen groß ist. Um eine maximale Energie der detektierten Photonen zu erreichen, muss die Parfokalität zwischen dem Lichtpunkt und dem detektierten Bereich, der durch die Lochblende abgebildet wird, aufrechterhalten werden. Viele Objektive, selbst die apochromatischen, bieten keine ausreichende Korrektur für Fluoreszenzverfahren, bei denen eine ultraviolette Anregung mit Emission im sichtbaren Bereich kombiniert wird. Es können zusätzliche optische Komponenten an der Ultraviolett-Laserquelle eingesetzt werden, um die fehlende Korrektur des Objektivs für den großen Wellenlängenbereich zu kompensieren, obwohl dies das konfokale System verteuert und seine Funktionsweise erheblich erschwert.

Hochleistungs-Wasserimmersionsobjektive und Silikonölimmersionsobjektive wurden speziell für die Anforderungen der Lebendzellbildgebung in der Forschung entwickelt. Vorrangiges Ziel ist es, eine optimale Leistung bei der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie von biologischen Proben zu erzielen, auch dann, wenn lebende Zellen und Gewebe in physiologischem Medium verwendet werden. Es ist wichtig zu erkennen, dass unabhängig vom Grad der Aberrationskorrektur, die in die Konstruktion eines Objektivs integriert ist, zusätzliche Aberrationen im optischen Pfad außerhalb des Objektivs verursacht werden können, beispielsweise wenn die Funktionsanforderungen der Konstruktion nicht eingehalten werden. Selbst die besten Komponenten weisen dadurch Leistungseinbußen auf.

Für Lebendzell- und physiologische Untersuchungen stehen Objektive zur Verfügung, die für die direkte Immersion oder das Eintauchen in Wasser konzipiert sind und über spezielle Nasen aus Keramik oder Polymer verfügen. Solche Untersuchungen erfordern häufig einen Zugang zur Probe für Messungen oder andere Manipulationen und können nicht mit Deckglas durchgeführt werden. Im Allgemeinen gehören Wasserimmersionsobjektive zur Kategorie der Fluorit-Objektive, die sowohl im ultravioletten als auch im infraroten Spektralbereich eine hohe Lichtdurchlässigkeit aufweisen und so konstruiert sind, dass sie einen großen Arbeitsabstand und ein schmales Profil des Eintauchteils an der Nase des Objektivs aufweisen. Die kleinere Winkelnase am Objektiv soll einen maximalen Zugang zur Probe ermöglichen, um Mikroelektroden anzubringen oder andere Arbeiten während der Beobachtung durchzuführen. Lange Arbeitsabstände, die bei einigen Objektiven dieser Art mehrere Millimeter betragen können, sorgen ebenfalls für einen besseren Zugang zur Probe. Der Eintauchteil vieler Immersionsobjektive besteht aus Keramik oder einem anderen inerten Isoliermaterial, um die elektrische Isolierung und chemische Beständigkeit zu gewährleisten. Durch die Kombination dieser Eigenschaften eignen sich Wasserimmersionsobjektive für konfokale, Multiphotonen- und viele andere Bildgebungsverfahren an lebenden Proben.

Neben der Vergrößerung, der numerischen Apertur und dem Grad der optischen Korrektur ist der Arbeitsabstand eines Objektivs von besonderer Bedeutung für die konfokale Mikroskopie und andere digitale Mikroskopietechniken, mit denen dreidimensionale Informationen von der Probe erfasst werden. Der Arbeitsabstand für ein Objektiv, das ein Deckglas benötigt, ist definiert als der Abstand zwischen der Oberseite des Deckglases und dem vorderen Linsenelement, wenn eine mit dem Deckglas in Berührung kommende Probenebene im Fokus ist (Abbildung 9(b)). Dieser Abstand ist wichtig, wenn die konfokale Bildgebung in verschiedenen Tiefen der Probe durchgeführt wird, da er die maximale fokale Eindringtiefe bestimmt, die erreicht werden kann, bevor das Objektiv die Oberseite des Deckglases berührt. Der Arbeitsabstand begrenzt daher den Bereich entlang der z-Achse, in dem Probendaten erfasst werden können.

So kann beispielsweise ein Objektiv mit einem Arbeitsabstand von 0,20 Millimetern (200 Mikrometer) bis zu einer maximalen Tiefe von 200 Mikrometern unterhalb des Deckglases fokussiert werden, bevor das Objektiv die Oberseite des Deckglases berührt. Innerhalb bestimmter Grenzen kann der Arbeitsabstand durch die optische Konstruktion variiert werden, obwohl er im Allgemeinen mit zunehmender Vergrößerung, numerischer Apertur und optischer Korrektur abnimmt. Ob eine hohe numerische Apertur und ein hohes Maß an Aberrationskorrektur bei großem Arbeitsabstand beibehalten werden können, ist von den geometrischen Einschränkungen abhängig, die sich aus der Form der Linsenelemente und der für ein stark korrigiertes Objektiv erforderlichen Anzahl ergeben. Viele der derzeit erhältlichen Objektive weisen dank der Verfügbarkeit verbesserter optischer Gläser, Linsenbeschichtungen und Computerdesigns bemerkenswerte Leistungssteigerungen auf.

Die Tatsache, dass die Signalintensität proportional zum Quadrat der numerischen Apertur ist, hat Auswirkungen auf die Wahl der Objektive für die konfokale Mikroskopie und verändert in einigen Fällen die relative Bedeutung der verschiedenen Leistungsfaktoren. Bei der Verwendung von konfokalen Scanning-Systemen mit Scan-Zoom-Funktion ist eine 100fache optische Vergrößerung nur selten erforderlich. Besser geeignet sind Objektive mit einer hohen numerischen Apertur und hochkorrigierten 40X und 60X Objektiven, da sie Bilder mit einem breiten Sichtfeld mit einem niedrigeren Scan-Zoom und hochauflösende subzelluläre Strukturbilder mit einem höheren Scan-Zoom aufnehmen können.

Viele gängige Verfahren, z. B. die Immunfluoreszenz-Bildgebung, leiden naturgemäß unter so geringen Lichtstärken, sodass die Übertragungseigenschaften des optischen Systems von entscheidender Bedeutung sind. Für die Erkennung kleinster Probendetails stehen unter Umständen nur wenige Photonen zur Verfügung, sodass ein relativ geringer Unterschied im Übertragungsgrad bei der Wellenlänge der Fluorophoranregung oder -emission für die Erkennbarkeit eines markierten Merkmals entscheidend sein kann. In manchen Situationen können die Übertragungseigenschaften des Objektivs von größerer Bedeutung sein als andere Spezifikationen wie Planität und Aberrationskorrektur, die zusätzliche Linsenelemente und Beschichtungen erfordern, um den Lichtverlust in einem kritischen Wellenlängenbereich zu erhöhen. Dank der Fortschritte in der Technologie zur Herstellung optischer Linsen wird dieser Kompromiss bei der Lichtdurchlässigkeit jedoch vermieden.

Die Zahl der spezialisierten Techniken für die Herausforderungen in der Zell- und Molekularbiologie sowie in anderen Bereichen hat zu veränderten Anforderungen an die optischen Abbildungssysteme geführt, insbesondere im Hinblick auf das Mikroskopobjektiv. Die starke Zunahme der Anwendung konfokaler Scanning-Techniken für dreidimensionale Untersuchungen biologischer Proben hatte einen großen Einfluss auf die kommerziell entwickelten Produkte, obwohl Methoden wie Laser Trapping, Multiphotonen-Anregung, Förster-Resonanzenergietransfer (FRET), Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) und Infrarot-Differentialinterferenzkontrast ebenfalls neue Anforderungen mit sich gebracht haben. Bei einer Reihe von Parametern für spezialisierte Techniken hat sich gezeigt, dass bestimmte klassische Leistungskriterien für Objektive zumindest teilweise geopfert werden können, um andere, kritischere Spezifikationen zu verbessern. Die enormen Fortschritte in der computergestützten Linsenkonstruktion und in der Zusammensetzung optischer Gläser sowie in der Technologie der Antireflexionsbeschichtung haben verbesserte Optiken hervorgebracht, die viele der neuen Anforderungen erfüllen können, ohne dass Abstriche bei der konventionellen Weitwinkelmikroskopie in Kauf genommen werden müssen. Beispiele hierfür sind für Hochleistung ausgelegte Silikonölimmersionsobjektive mit höherer numerischer Apertur, größerem Arbeitsabstand, Korrekturringen für sphärische Aberration und Objektive mit verbesserter Ultraviolett- und Infrarotübertragung. Darüber hinaus ermöglichen Objektive mit ultradünnen Linsen eine hohe numerische Apertur, eine hohe Lichtdurchlässigkeit, eine Korrektur der chromatischen Aberration in einem breiteren Spektralbereich und eine erweiterte Planität, ohne Kompromisse bei diesen Spezifikationen einzugehen.

Viele moderne Objektive sind für die konfokale Mikroskopie geeignet, wenn sie entsprechend ihren Konstruktionsspezifikationen verwendet werden. Die hochauflösende Untersuchung und genaue dreidimensionale Abbildung dicker wässriger Proben mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop ist besonders anspruchsvoll und erfordert ein Objektiv, das alle folgenden Kriterien erfüllt: hohe numerische Apertur für eine effiziente Erfassung der Fluoreszenz, großer Arbeitsabstand für eine maximale Eindringtiefe, Planität für eine genaue dreidimensionale Rekonstruktion, geringe axiale chromatische Aberration für die Parfokalität mehrerer Fluorophore und geringe laterale chromatische Aberration, um eine präzise Registrierung mehrerer Fluoreszenzbilder zu ermöglichen, sowie eine hohe Transmission bei den Anregungs- und Emissionswellenlängen.