Laser-Scanning-Mikroskope - eine Einführung
Laser-Scanning-Mikroskope verwenden eine Laserbeleuchtung, um hochauflösende, kontrastreiche 3D-Bilder von Proben zu erzeugen, indem sie Punkt für Punkt gescannt werden. Zwei gängige Arten von Laser-Scanning-Mikroskopen sind konfokale Laser-Scanning-Mikroskope und Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskope. Auch wenn beide eine Laserbeleuchtung zur Anregung der Probe verwenden, weisen sie doch einige wesentliche Unterschiede auf. Im Folgenden werden Funktionsweise und Verwendung von konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopen und Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskopen und die Art der von ihnen erzeugten Bilder erklärt.
Konfokale Laser-Scanning-Mikroskope |
Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskope |
Funktionsweise von konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopen
Konfokale Laser-Scanning-Mikroskope verwenden einen kontinuierlichen Laserstrahl mit kurzen Wellenlängen, der ein sehr intensives Anregungslicht erzeugt, um die Probe zu beleuchten. Diese Laserbeleuchtung wird von einem Strahlteilerspiegel und dann von zwei weiteren Spiegeln reflektiert, die wiederum den Laserstrahl über einer gefärbten Probe scannen. Bei Anregung durch den Laserstrahl fluoresziert der Farbstoff in der Probe und gibt Licht mit langer Wellenlänge ab, das von den Spiegeln, die zuvor zur Abtastung des Anregungslichts verwendet wurden, erfasst wird. Das emittierte Licht passiert dann den Strahlteilerspiegel, wo es durch eine Lochblende fokussiert und vom Detektor erfasst und gemessen wird. Der Detektor ist mit einem Computer verbunden, der Punkt für Punkt ein digitales 3D-Bild erstellt. Da die Lochblende die Fluoreszenz außerhalb des Fokus ausblendet, ist das erzeugte Bild sehr detailliert. Im Prinzip fokussieren bei der Laser-Scanning-Mikroskopie der Laserstahl und der Detektor denselben Punkt der Probe und dieser Punkt verschiebt sich, bis letztendlich ein vollständiges Bild der Probe vorliegt. |
Funktionsweise von Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskopen
Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskope funktionieren sehr ähnlich wie konfokale Laser-Scanning-Mikroskope. Während jedoch konfokale Laser-Scanning-Mikroskope einen Laserstrahl mit kurzer sichtbarer Wellenlänge verwenden, um die Probe anzuregen, wird bei der Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskopie ein IR-Femtosekunden-Impulslaserstrahl verwendet, der bei Wellenlängen emittiert wird, die doppelt so lang sind, wie es für die Einzelphotonenanregung erforderlich ist. Wenn der Farbstoff in der Probe gleichzeitig zwei Photonen absorbiert, kann er Fluoreszenz emittieren. Dieses Zwei-Photonen-Absorptionsphänomen tritt nur an der Fokusposition auf, wo die Photonendichte hoch ist. Nur der Farbstoff am Fokuspunkt kann angeregt werden und Fluoreszenz emittieren. Daher benötigt ein Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskopsystem keine Lochblende, um Fluoreszenz außerhalb des Fokus für seinen Non-Descanned Detector (NDD) auszublenden, und die Fluoreszenz am Fokuspunkt kann effizient erfasst werden. Die andere Anregungsmethode ist möglich, weil der Laser mit längerer Wellenlänge tief in das Gewebe vordringt, wodurch Lebendgewebe bis zu einer Tiefe von Hunderten von Mikrometern beobachtet und abgebildet werden kann. Zudem ist die Phototoxizität im Vergleich zu kurzwelligen sichtbaren Laserstrahlen reduziert. Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskope eignen sich daher besser zur In-vivo-Untersuchung von Zellen und Geweben.
Verwendung von Laser-Scanning-Mikroskopen
Auch wenn konfokale Laser-Scanning-Mikroskope in vielen Bereichen sehr nützlich sind, werden sie am häufigsten in der biologischen Forschung eingesetzt. Besonders gängig sind sie in der zellbiologischen Forschung, Krebsforschung und Stammzellforschung, da konfokale Laser-Scanning-Mikroskope sehr detaillierte 3D-Bilder von Zellen erzeugen können, die es dem Beobachter ermöglichen, in das Innere der gescannten Probe zu blicken. Dies liegt daran, dass konfokale Laser-Scanning-Mikroskope Licht optisch teilen können, um hochauflösende Bilder von dicken Gewebeproben zu erzeugen, ohne dass die Probe physisch geschnitten werden muss. Aufgrund des tiefen Eindringens des IR-Femtosekundenlasers eignen sich Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskope am besten für die Darstellung von Lebewesen in vivo. Daher werden sie häufig für die neurowissenschaftliche Forschung und die Krebsforschung ausgewählt.
Vor- und Nachteile von Laser-Scanning-Mikroskopen
Laser-Scanning-Mikroskope sind ein wesentlicher Bestandteil bei der Untersuchung von Zellen und biologischen Geweben, nicht zuletzt dank ihrer Fähigkeit, Proben Punkt für Punkt zu erfassen. Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit, hochauflösende, kontrastreiche 3D-Bilder von Zellen und Geweben zu erstellen, ohne dass die Probe physisch geschnitten werden muss.
Laser-Scanning-Mikroskope können solche hochqualitativen Bilder erzeugen, weil unscharfes Fluoreszenzlicht durch die konfokale Lochblende so effizient zurückstrahlt, dass immer nur ein fokussierter Punkt vom Detektor erfasst wird.
Das ist auch der Grund dafür, dass es sehr lange dauern kann, bis ein vollständiges 3D-Bild einer Probe erstellt ist. Bei modernen Geräten wurde dieser Prozess inzwischen beschleunigt. Im Vergleich zur herkömmlichen Galvanometer-Scannern ermöglichen Resonanz-Scanner eine schnellere Bildgebung mit bis zu 30 Bildern pro Sekunde, um schnelle, dynamische Vorgänge wie den Blutstrom oder den Ionenstrom in Zellen zu beobachten.
Laser-Scanning und Spinning Disk - ein Vergleich
Ein Beispiel für einen technologischen Fortschritt, der die Punkt-für-Punkt-Erfassung mit Laser-Scanning-Mikroskopen beschleunigte, ist die Einführung einer Spinning Disk. Bei der konfokalen Mikroskopie mit einer Spinning-Disk spielt die Anzahl der Lochblenden eine Rolle, die verwendet werden, um das unscharfe Fluoreszenzlicht zu blockieren. Während konfokale Laser-Scanning-Mikroskope eine Einzellochblende aufweisen, wird bei der konfokalen Mikroskopie mit Spinning-Disk eine opake Scheibe mit Hunderten von Löchern verwendet, die sich mit hoher Geschwindigkeit dreht. So kann die gesamte Probe auf einmal, anstatt Punkt für Punkt, erfasst werden. Dies kann auch dazu beitragen, Lichtschäden und Lichtbleichen zu reduzieren.
Von einem Laser-Scanning-Mikroskop erzeugte Bilder
Wie bereits erwähnt, entstehen die hohe Auflösung und der hohe Kontrast der Bilder des konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops dadurch, dass das nichtfokussierte Fluoreszenzlicht durch die Lochblende zurückstrahlt, bevor es den Detektor erreicht. Nachdem das 3D-Bild erfasst wurde, kann es beim Betrachten in bestimmten Fällen manipuliert und untersucht werden.
Laser-Scanning-Mikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie - ein Vergleich
Der Hauptunterschied zwischen einem Laser-Scanning-Mikroskop und einem Rasterelektronenmikroskop liegt in der Methode zur Beleuchtung der Probe. Während die Laser-Scanning-Mikroskopie einen oder mehrere Laserstrahlen für die Anregung verwendet, wird bei der Rasterelektronenmikroskopie, wie der Name schon sagt, die Probe mit einem Elektronenstrahl bestrahlt. Von der Oberfläche der Probe reflektierte Elektronen oder Sekundärelektronen erzeugen Signale über die Topographie oder Zusammensetzung der Probe, die von einem Detektor erfasst werden. Die Rasterelektronenmikroskopie kann nicht zur Beobachtung lebender Proben eingesetzt werden, da sich die Probe in einem Vakuum befinden muss.
Vergrößerung mit Laser-Scanning-Mikroskop
Laser-Scanning-Mikroskope können mit einer Vielzahl von Vergrößerungsobjektiven verwendet werden. Daher hängt die maximale Vergrößerung des Laser-Scanning-Mikroskops vom verwendeten Objektiv ab. Objektive mit geringer Vergrößerung eignen sich, um die Struktur einer ganzen Gewebeprobe zu erfassen. Wenn die Morphologie der Zellen eines Gewebes erfasst werden sollen, genügt meist ein Objektiv mit mittlerer Vergrößerung. Objektive mit hoher Vergrößerung können dann verwendet werden, um die Mikrostruktur innerhalb der Gewebezellen zu betrachten.
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