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Im Rahmen eines Gemeinschaftsprojekts mit dem RIKEN (Quantitative Biology Center, Japan) hat der Geschäftsbereich Scientific Solutions der Olympus Corporation (President: Hiroyuki Sasa) eine neue Super Resolution-Fluoreszenzmikroskopietechnologie entwickelt, die die Beobachtung der Ultrastruktur von Lebendzellen bei deutlich reduzierter Bildaufnahmezeit ermöglicht.

In der Mikroskopie bestehen gewisse Grenzen in Bezug auf räumlichen Auflösung,^*1. Für die Untersuchung der feinen Details eines Objekts und die räumliche Auflösung eines optischen Mikroskops gilt in der Regel ein Maximum von 200 nm.^*2 Die Super Resolution-Mikroskopie hat diese Grenzen durchbrochen und ermöglicht die Untersuchung noch feinerer Strukturen. Der Nobelpreis für Chemie wurde 2014 an Forscher vergeben, die sich mit Super Resolution-Fluoreszenzmikroskopietechnologie befassen, und zwar für ihre bahnbrechende Erfindung, die im Bereich Life Sciences zu bedeutenden Forschungsfortschritten geführt hat.

Unsere neue Technologie ermöglicht eine räumliche Auflösung von ca. 100 nm, vergleichbar mit der Auflösung bei Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (SIM),^*3 eine von mehreren Super Resolution-Fluoreszenzmikroskopietechnologien mit einer zeitlichen Auflösung von 1/100 Sekunde.^*4 Die neue Technologie ermöglicht die Darstellung der schnellen Dynamik von Organellen^*5, die sich in Lebendzellen aktiv umherbewegen. Mit herkömmlichen Super Resolution-Fluoreszenzmikroskopietechnologien konnte dies nicht erreicht werden, da die Bildaufnahme zwischen einer Sekunde und mehreren Minuten dauert.Dieser bahnbrechende Fortschritt bei der Super Resolution-Fluoreszenzmikroskopie wird voraussichtlich unser Verständnis biologischer Phänomene deutlich erweitern.

Diese Technologie lässt sich durch eine Modifizierung herkömmlicher konfokaler Mikroskope*6 erzielen. Es wird erwartet, dass das Gerät einfach installiert werden kann im Vergleich mit anderen existierenden Super Resolution-Fluoreszenzmikroskopen.

Die Veröffentlichung der Online-Version dieses Artikels zu der Technologie erfolgte vor der Druckversion (25. Februar), die in der Ausgabe der Fachschrift „Molecular Biology of the Cell“ der American Society for Cell Biology vom 1. Mai erscheint.

Hinweise:
*1: Die Fähigkeit zur Unterscheidung zweier Punkte oder Linien. Kleinere Werte bedeuten eine höhere räumliche Auflösung, was die Untersuchung feinerer Strukturen ermöglicht
*2: Ein Nanometer (nm) entspricht einem millionstel Millimeter
*3: Eine Methode zur Erhöhung der räumlichen Auflösung um einen Faktor von maximal 2 verglichen mit herkömmlicher Mikroskopie. Dazu werden die Moiré-Artefakte von 9 bis 25 Bildern analysiert, die durch die Projektion von Streifenmustern entstehen
*4: Die minimale Zeitänderung, die eine erkennbare Änderung des untersuchten Bilds bewirkt. Kleinere Werte bedeuten eine höhere räumliche Auflösung, was die Unterscheidung von Bildern ermöglicht, die sich mit hoher Geschwindigkeit ändern
*5: Subzelluläre Komplexe mit spezifischen Strukturen und Funktionen wie das endoplasmatische Retikulum, Golgi-Körper und Mitochondrien
*6: Dieser Mikroskoptyp ermöglicht dreidimensionales Imaging. Dazu wird ein Anregungsstrahl auf eine Probe fokussiert und jegliches Fluoreszenzlicht, das nicht vom Fokuspunkt ausgeht, blockiert.

Geschäftsbereich Scientific Solutions:
Zu den Hauptprodukten von Olympus Scientific Solutions zählen optische Mikroskope, industrielle Endoskope und Geräte zur zerstörungsfreien Prüfung.Olympus leistet einen Beitrag zur F&E im Gesundheitswesen sowie in den Bereichen Life Science und Industrie, zur Verbesserung der Qualitätskontrolle an Produktionsstandorten und zur Sicherheit und Zuverlässigkeit sozialer Infrastrukturen durch die Inspektion von Flugzeugen und großen Industrieanlagen.

(Referenzmaterial: Forschungsübersicht)

<Hintergrund >:
Im 19. Jahrhundert haben der deutsche Physiker Ernst Abbe und andere Forscher gezeigt, dass die räumliche Auflösung eines optischen Mikroskops auf ungefähr die halbe Wellenlänge des verwendeten Lichts begrenzt ist (Beugungsgrenze). Lange wurde geglaubt, dass das kleinste unter einem Mikroskop im Bereich des sichtbaren Lichts untersuchbare Objekt 200 nm groß ist.Im 21. Jahrhundert wurden verschiedene Super Resolution-Fluoreszenzmikroskope entwickelt mit dem Ziel, eine räumliche Auflösung zu erreichen, die die Beugungsgrenze übertrifft.So konnte eine räumliche Auflösung von 100 nm oder weniger erreicht werden.Diese Super Resolution-Fluoreszenzmikroskopiemethoden sind aber sehr zeitaufwändig und daher ungeeignet für das Lebendzell-Imaging (hier werden lebende Zellen untersucht).Aus diesem Grund haben wir uns bei dieser Studie auf die Entwicklung eines Mikroskops mit einer zeitlichen Auflösung von 1/100 Sek. konzentriert, was Lebendzell-Imaging ermöglicht.

<Technologie>:
Der Schwerpunkt bei der Analyse lag auf der Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (SIM), eines der herkömmlichen Super Resolution-Fluoreszenzmikroskopieverfahren.Es stellte sich heraus, dass es theoretische Gemeinsamkeiten zwischen SIM-Imaging und Konfokalmikroskopie-Imaging gab.Wir haben diesen Sachverhalt mit unserer Disk Scanning Unit (DSU, System mit rotierender Blendenscheibe) näher untersucht und herausgefunden, dass Super Resolution-Bilder mit einer vergleichbaren Qualität wie bei SIM möglich sind, wenn das Streifenmuster auf einer rotierenden Blendenscheibe abgeändert wird.Demgemäß haben wir die Technologie „Spinning Disk Super-Resolution Microscopy (SDSRM)“ genannt (Abbildung 1).
Anschließend wurde mit fluoreszierenden Kügelchen die räumliche Auflösung des Systems in einem Experimentaufbau untersucht, der das Prinzip verifizieren sollte. In Übereinstimmung mit den theoretischen Berechnungen zeigte sich, dass eine räumliche Auflösung von ca. 100 nm erreicht werden konnte (Abbildung 2).Des Weiteren waren wir in der Lage, die Ultrastruktur lebender Zellen mit einer räumlichen Auflösung von 100 nm bei maximaler Verschlussgeschwindigkeit von 1/100 Sek (zeitliche Auflösung) zu untersuchen. Dazu wurden die Kamera und die Lichtquelle durch Modelle ausgetauscht, die besser für das Hochgeschwindigkeits-Imaging geeignet waren.

Abbildung 1.Schematische Darstellungen eines Super Resolution-Mikroskops mit rotierender Blendenscheibe
Links: schematische Darstellung des LichtwegsDas Beleuchtungslicht (blau) und das Licht von der Probe (grün) treten durch die gleiche Position auf der Blendenscheibe, wodurch der Konfokaleffekt erzeugt wird.
Rechts: schematische Darstellung des Streifenmusters auf der Blendenscheibe.Die Super Resolution-Beobachtung wurde ermöglicht durch die Erzeugung eines Streifenmusters, das feiner ist als herkömmliche Muster.

Abbildung 2. Machbarkeitsexperiment mit fluoreszierenden Kügelchen
Links: Bildaufnahme mit einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop
Rechts: Bildaufnahme mit dem Super Resolution-Mikroskop mit rotierender Blendenscheibe
(Maßstabskala, 500 nm)

<Ergebnisse>
Die Entwicklung der Super Resolution-Mikroskopietechnik mit rotierender Blendenscheibe hat die Untersuchung der Dynamik von Ultrastrukturen in lebenden Zellen ermöglicht.Da für dieses Verfahren lediglich herkömmliche konfokale Mikroskope modifiziert werden müssen, ist die Einführung in diese Technik einfacher als bei anderen existierenden Super Resolution-Fluoreszenzmikroskopieverfahren.Durch die Weiterentwicklung des Prinzips des Spinning-Disk-Super Resolution-Mikroskopieverfahrens sollten sich Anwendungsmöglichkeiten in weiteren konfokalen Mikroskopieverfahren ergeben.

Informationen zum Artikel
Titel: Ultraschnelles Super Resolution-Fluoreszenz-Imaging mit Spinning-Disk-Konfokalmikroskop-Optik
Autoren: Shinichi Hayashi und Yasushi Okada
Erschienen in: Molecular Biology of the Cell
DOI:10.1091/mbc.E14-08-1287 (Online-Veröffentlichung vor Druckausgabe)

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