Eine Einführung in das Gradientenkontrastverfahren

1. Einführung

Seit der Erfindung des Mikroskops im 16. Jahrhundert haben Lichtmikroskope einen großen Beitrag zur biologischen Forschung geleistet, unter anderen bei der Entdeckung von Mikroorganismen und roten Blutkörperchen. Mit der Entwicklung der Technik der Probenfärbung im 19. Jahrhundert konnten transparente Strukturen mit Farbkontrastmitteln besser sichtbar gemacht werden. Allerdings hat die Färbung eine toxische Wirkung, was ihre Verwendung bei lebenden Proben einschränkt. Ab dem 20. Jahrhundert wurden verschiedene Verfahren zur Betrachtung von nicht gefärbten, transparenten Objekten entwickelt, die bis heute unverzichtbare Werkzeuge in der biologischen Forschung sind. Ein Beispiel dafür ist die Phasenkontrastmikroskopie.

2. Verschiedene Phasenkontrastverfahren

Die gebräuchlichen Verfahren zur Darstellung von Phasen bei der Untersuchung transparenter, ungefärbter Objekte sind in Abbildung 1 zusammen mit den jeweiligen Anordnungen der optischen Elemente kurz erläutert. Bei herkömmlichen Verfahren zur Darstellung von Phasen werden spezielle optische Elemente in der Kondensor- bzw. Objektivpupille platziert.

Beim Phasenkontrastverfahren (Abbildung 1a) wird eine Kombination aus einer speziellen Kondensorlinse mit einer Ringblende und einer speziellen Objektivlinse mit einem Phasenfilmring verwendet. Beim Lichteinfall durch die Ringblende des Kondensors passieren die Strahlen, die gerade durch die Probe verlaufen, den Phasenfilm der Objektivpupille. Strahlen, die von der Probe gebeugt werden, verlaufen dagegen außerhalb des Phasenfilms und erzeugen an der Stelle, an der die beiden Komponenten miteinander interferieren, einen Licht- und Schattenkontrast. An den Stellen, an denen sich die Brechungsindexverteilung in der Probe ändert, entstehen Lichthöfe oder Halos, ein charakteristisches Merkmal dieses Prozesses. Dicke Proben sind aufgrund des starken Lichthofeffekts für dieses Verfahren nicht geeignet.

Beim differenziellen Interferenzkontrastverfahren (Abbildung 1b) kommt ein polarisiertes Scherinterferometer mit komplementären Wollaston-Prismen an der Kondensor- und der Objektivpupille zum Einsatz. Aus dem Probenbild wird ein Doppelbild, das in einer festen Richtung leicht verschoben ist, und die Brechungsindexstufe der Probe wird verschattet, um das Bild dreidimensional erscheinen zu lassen. Aufgrund der Polarisationsinterferenz sind Petrischalen aus Kunststoff oder andere Objekte, die im Strahlengang eine Polarisationsverzerrung verursachen, für dieses Verfahren nicht geeignet.

Beim Modulationskontrastverfahren (Abbildung 1c) wird der Beleuchtungsstrahl mit Hilfe der Spaltöffnung der Kondensorpupille in eine Richtung begrenzt. Der Lichtstrahl wird so geführt, dass der gerade Anteil des Lichts in der Probe grau erscheint, während sich der Kontrast des gebrochenen Anteils dank des Modulators der Objektivpupille je nach Brechungsrichtung ändert. Wird ein Teil des Lichts durchgelassen oder abgeschirmt, entsteht ähnlich wie beim differenziellen Interferenzkontrastverfahren ein dreidimensionales Bild. Da beim Modulationskontrastverfahren keine Polarisation stattfindet, können Petrischalen und andere Gefäße aus Kunststoff verwendet werden. Allerdings ist die Auflösung bei diesem Verfahren etwas geringer, da aufgrund der Begrenzung der Richtung des Lichtstrahls die numerische Apertur (NA) der Beleuchtung klein ist.

Abbildung 1. Optische Anordnung bei den verschiedenen Verfahren zur Darstellung von Phasen

Die optischen Elemente, die für die verschiedenen Verfahren zur Darstellung von Phasen notwendig sind. a. Phasenkontrastverfahren, b. Differenzielles Interferenzkontrastverfahren, c. Modulationskontrastverfahren, d. Gradientenkontrastverfahren.

3. Gradientenkontrastverfahren

Beim Gradientenkontrastverfahren (Abbildung 1d) wird ähnlich wie beim differenziellen Interferenzkontrastverfahren ein pseudo-dreidimensionales Bild erzeugt. Während andere Verfahren zur Darstellung von Phasen mehrere optische Komponenten erfordern, um einen Kontrast in ungefärbten Proben zu erzeugen, muss zur Erzeugung des Gradientenkontrasts lediglich ein Gradienten-ND-Filter in die Objektivpupille eingesetzt werden.

Prinzip des Gradientenkontrastverfahrens

Der in die Pupille des Objektivs eingesetzte Gradienten-ND-Filter hat in einer Richtung eine gleichmäßig abnehmende Lichtdurchlässigkeit. Der Aperturdurchmesser der Kondensorlinse, der auf die Pupillenposition des Objektivs projiziert wird, ist etwas kleiner als der Pupillendurchmesser des Objektivs. Dort, wo die Brechungsindexverteilung der Probe flach ist, wird das Aperturbild der Kondensorlinse auf die Mitte der Objektivpupille projiziert und anschließend durch den Grad der Lichtdurchlässigkeit in der Nähe der Mitte des Gradienten-ND-Filters beeinflusst (Abbildung 2a). Bei einer Neigung in der Brechungsindexverteilung der Probe ist das Aperturbild der Kondensorlinse gegenüber der Mitte des Gradienten-ND-Filters verschoben, so dass sich die Gesamtdurchlässigkeit des Gradienten-ND-Filters ändert, wenn sich der Lichtstrahl an der Probe bricht (Abbildung 2b und c). Daher erfolgt die Abbildung mit einer Helligkeit, die der Neigung des Brechungsindex der Probe entspricht. Die Brechungsindexverteilung der Probe erscheint dreidimensional (Abbildung 2d).

Die Apertur der Kondensorlinse kann mit Hilfe der Aperturblende eingestellt werden. Bei einer relativ großen Apertur ist die Helligkeitsänderung aufgrund der Neigung des Brechungsindex der Probe möglicherweise nicht ausreichend. Daher wird das mit dem Bildsensor aufgenommene Bild hervorgehoben und in einem gut erkennbaren Kontrast dargestellt.

Abbildung 2. Veranschaulichung des Gradientenkontrastverfahrens

Beschreibung des Prinzips des Licht- und Schattenkontrasts auf einem Phasenobjekt beim Gradientenkontrastverfahren. a. Bei einer flachen Phasenverteilung der Probe verläuft der Lichtstrahl gerade und passiert den geneigten ND-Filter ungefähr in der Mitte. b, c. Bei einer geneigten Phasenverteilung der Probe werden die Lichtstrahlen so gebrochen, dass die Richtung der Neigung entweder durch den helleren Teil des geneigten ND-Filters (b) oder durch den dunkleren Teil (c) verläuft. d. Das Mikroskopbild wird mit einem Licht- und Schattenkontrast betrachtet, der von der Neigungsrichtung der Phasenverteilung der Probe abhängt.

Merkmale des Gradientenkontrastverfahrens

Das mit dem Gradientenkontrastverfahren erzeugte Phasenbild hat viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Verfahren zur Darstellung von Phasen. Das Gradientenkontrastverfahren kann bei dicken Proben angewendet werden, da im Gegensatz zum Phasenkontrastverfahren keine Lichthöfe entstehen. Da es im Gegensatz zum differenziellen Interferenzkontrastverfahren nicht auf Polarisation basiert, können pseudo-dreidimensionale Bilder von Proben auch durch Kunststoffgefäße hindurch erzeugt werden. Da die NA der Beleuchtung größer ist als bei anderen Verfahren, ist dieses Verfahren außerdem weniger anfällig für Probleme, die bei der Bildgebung durch den Deckel einer Petrischale entstehen, an dem sich Wassertröpfchen befinden. Anders als beim Modulationskontrastverfahren mit Verwendung eines Abschirmelements verschlechtert sich dank dieser Eigenschaft die Auflösung hier nicht. Ein weiterer praktischer Vorteil besteht darin, dass weder ein spezielles Objektiv noch ein Wechsel der optischen Elemente bei Objektivumstellungen erforderlich sind, was das Mikroskopieren schneller und einfacher macht.

Optische Anordnung für das Gradientenkontrastverfahren

Die optische Anordnung des APX100 Bildgebungssystems ist in Abbildung 3 dargestellt. Das Licht gelangt entlang des Strahlengangs durch die Probe und wird auf der Abbildungsfläche abgebildet.

Ein Gradienten-ND-Filter wird an einer Position entsprechend der Pupillenposition des Objektivs angebracht. Dieser Filter gelangt nur dann in den Strahlengang, wenn das System auf das Gradientenkontrastverfahren eingestellt ist. Der Öffnungsdurchmesser des Kondensors wird in Abhängigkeit von der Vergrößerung und dem Pupillendurchmesser des Objektivs automatisch auf den optimalen Wert eingestellt.

Abbildung 3. Optische Anordnung des APX100 für die Gradientenkontrastmikroskopie von ungefärbten Proben

Anwendungen

Im Folgenden wurden HeLa-Zellen in den Gefäßen 1 und 2 mit einem 10x Objektiv betrachtet und Bilder mit den vier zuvor besprochenen Mikroskopieverfahren aufgenommen und anschließend verglichen.

1. Schale mit Glasboden ※Mit aufgesetztem Kunststoffdeckel
2. 12-Well-Mikroplatte ※Wassertröpfchen haften oben am Kunststoffdeckel

Vergleich der Ergebnisse:

1. Das Gradientenkontrastbild ist vergleichbar mit dem Phasenkontrast- und dem Modulationskontrastbild. Beim differenziellen Interferenzkontrastbild ist die Polarisationsleistung durch den Kunststoffdeckel reduziert, so dass der Kontrast gering ist.
2. Im Vergleich zu anderen Mikroskopieverfahren hat das Gradientenkontrastbild ein gleichmäßigeres Sichtfeld und einen guten Kontrast. Die NA der Beleuchtung ist größer als bei anderen Mikroskopieverfahren und wird durch Fremdkörper auf der Probe und Wassertröpfchen im Gefäß weniger stark beeinträchtigt.

4. Zusammenfassung

Das Gradientenkontrastverfahren ist ein Verfahren zur Darstellung von Phasen, bei dem ein einfacher optischer Aufbau verwendet wird, der nur die Verwendung eines einzelnen Gradienten-ND-Filters in der Objektivpupille erfordert. Es eignet sich gut für die Betrachtung transparenter, ungefärbter Lebendproben. Im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren zur Darstellung von Phasen zeichnet sich das Gradientenkontrastverfahren durch folgende Vorteile aus:

• Das Verfahren eignet sich für dicke Proben
• Es können Petrischalen aus Kunststoff verwendet werden
• Es können Petrischalen mit Deckel verwendet werden, sodass das Risiko einer Kontamination der Zellkultur verringert wird
• Es wird kein spezielles Objektiv benötigt
• Bei einer Objektivumstellung ist kein Wechsel der optischen Elemente erforderlich

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