Procesamiento de imágenes de la localización intracelular a partir de las interacciones proteína-proteína con NanoBiT®

Una interacción proteína-proteína (PPI) es el contacto físico directo entre dos proteínas. Teniendo en cuenta que las proteínas llevan a cabo la mayoría de los procesos celulares y raramente funcionan solas, es importante estudiar las interacciones de las proteínas por pares o grupos más grandes en todos los campos de investigación, como en el desarrollo de fármacos y la investigación de enfermedades. Existen varios métodos que permiten monitorizar las interacciones proteína-proteína sin usar células, pero estos modelos no reflejan con precisión el entorno intracelular. También, algunos métodos de monitorización de la PPI al usar células requieren lisis y dispositivos especializados para la detección cuantitativa.

A fin de superar estos desafíos, la empresa Promega ha desarrollado la NanoLuc^® Binary Technology (o de forma abreviada NanoBiT^®). La NanoBiT^® consiste en un sistema de notificación de complementación estructural que puede usarse para detectar la PPI a nivel intracelular. Ha sido usada con éxito en una variedad de campos de investigación, como en la selección de medicamentos, el análisis de la transducción de señales y el análisis de los mecanismos de infección viral.

Este sistema está compuesto por una subunidad mayor de proteína BiT (LgBiT; 17,6 kDa) y una menor (SmBiT; 11 aminoácidos), cuya fusión se da con proteínas de interés. Estas subunidades se expresan a continuación en la célula, por lo que sólo la PPI diana hace que las subunidades formen una enzima funcional que genera una señal de luminiscencia brillante (Figura 1).

Figura 1. Descripción general del sistema de interacción proteína-proteína NanoBiT®.
^{Imagen por cortesía de Promega.}
 

Procesamiento de imágenes de la localización intracelular de los vectores NanoBiT

Para que se cumpla la expresión citosólica y nucleica, se ejecuta la transfección de dos tipos de pares de vectores en células HeLa. El primer par está compuesto por un vector de control FKBP-SmBiT y un vector de control FRB-LgBiT no dirigidos. El segundo par está compuesto por un vector de control NLS¹-FKBP-SmBiT y un vector de control FRB-LgBiT (Figura 2) dirigidos al núcleo. Se sabe que los vectores FKBP y FRB se unen bajo tratamiento con rapamicina (sirólimus).

Figura 2. Localización intracelular de FKBP/FRB y NLS-FKBP/FRB de NanoBiT
 

La bioluminescencia que se produce a partir de las células Hela, mediante la expresión del sistema NanoBit, es capturada en imagen mediante el sistema microscópico IXplore™ Live dedicado a la luminiscencia². Para confirmar la localización del núcleo, las células HeLa son contrateñidas con Hoechst33342 y procesadas en imagen con el mismo microscopio usando fluorescencia (Figura 3).

Se observa que la señal de bioluminiscencia en las células HeLa que recibieron los vectores FKBP/FRB de NanoBiT no dirigidos se extiende por todo el citosol. Sin embargo, se confirma que la bioluminiscencia de los vectores NLS-FKBP/FRB de NanoBiT se encuentra localizada en el núcleo debido a su superposición con la tinción de fluorescencia Hoechst33342.

Figura 3. Localización intracelular de FKBP/FRB y NLS-FKBP/FRB de NanoBiT
 

Condiciones experimentales:

• Microscopio: Sistema microscópico IXplore Live para luminiscencia²
• Cámara: Cámara EM-CCD imagEM (Hamamatsu Photonics)
• Objectivo: LUCPLFLN60XPH
• Lente de procesamiento de imagen: 0.35X
• Ganancia EM: 1200
• Concentración de furimazina: Dilución de 1/200
• Concentración final de rapamicina/sirólimus: 30 nM
• Tiempo de exposición: Contraste de fase de 50 ms / Bioluminiscencia de 3 min / Fluorescencia de 100 ms

La Figura 4 muestra el cambio en la bioluminiscencia de los vectores NLS-FKBP/FRB de NanoBiT antes y después de la estimulación con rapamicina/sirólimus. La intensidad de la bioluminiscencia en el núcleo aumentó tras la estimulación con rapamicina/sirólimus. Estos resultados muestran que los vectores FKBP y FRB se unen en el núcleo mediante el tratamiento con rapamicina/sirólimus, y la interacción induce la bioluminiscencia de NanoLuc. El procesamiento de imágenes microscópico ha permitido observar la interacción de los vectores FKBP y FRB, inducida a partir de la estimulación con rapamicina/sirólimus, mediante los cambios de intensidad de bioluminiscencia citosólica y nucleica en la célula viva.

Figura 4. Cambios de intensidad de la bioluminiscencia de los vectores NLS-FKBP/FRB por estimulación con rapamicina/sirólimus
 

Condiciones experimentales:

• Vectores: NLS-FKBP-SmBiT/FRB-LgBit (50 ng cada uno)
• Microscopio: Sistema microscópico IXplore Live para luminiscencia²
• Cámara: Cámara EM-CCD imagEM (Hamamatsu Photonics)
• Ganancia EM: 1200
• Objetivo: UPLFLN40XPH
• Lente de procesamiento de imagen: 0.35X
• Tiempo de exposición: Contraste de fase de 50 ms / Bioluminiscencia de 30 min / Fluorescencia de 100 ms
• Intervalo de tiempo: 40 segundos

Detección de la PPI usando un luminómetro y microscopía de luminiscencia

Las tecnologías NanoBiT y HiBiT³ permiten detectar interacciones proteína-proteína (PPI) de alto rendimiento con un luminómetro; a su vez, el procesamiento de imágenes microscópico en función de estas tecnologías posibilita la visualización de la localización intracelular de estas PPI.

La combinación de un luminómetro con un microscopio de luminiscencia dedicado a detectar las PPI ofrece varias ventajas. Al observar, a nivel local, las PPI o los cambios que ocurren en su localización intracelular, es posible confirmar la precisión de la localización usando un procesamiento de imágenes anterior a una medición de alto rendimiento con un luminómetro. Este sistema elimina la necesidad de un procesamiento de fluorescencia adicional para confirmar la localización intracelular. Es posible usar la misma línea celular construida en la que se expresan las proteínas NanoBiT o HiBiT con el fin de verificar la localización intracelular y llevar a cabo la detección de alto rendimiento del luminómetro.

Autor

Taro Hayashi
investigador, Ingeniería Biológica / Óptica Avanzada / Investigación y Desarrollo de Evident

^1. Señal de localización del núcleo (se usó tres veces la señal de localización reiterada del núcleo).

^2. Sistema de procesamiento de imágenes de bioluminiscencia basado en el microscopio IXplore Live. Este sistema fue diseñado gracias a los resultados de desarrollo conjunto entre el profesor Nagai de la Universidad de Osaka, Japón, (Tokai Hit., Co, Ltd.) y Evident. Este estudio se llevó a cabo a través del programa de la Agencia de Ciencia y Tecnología de Japón que incita el desarrollo de sistemas avanzados de medición y análisis.

^3. Tecnología HiBiT que permite detectar la proteína diana a través de la bioluminiscencia usando un marcador péptido de 11 aminoácidos (HiBiT) y un fragmento de luciferasa NanoLuc de aproximadamente 18 kDa (LgBiT).