Procesamientos de imágenes de bioluminiscencia, contraste de fases y fluorescencia aplicados en células vivas, incubadas dentro de placas con la base de plástico, mediante el uso de una lente de objetivo con contraste de fases y alta apertura numérica (A. N.) de 20X

Introducción
Procesamiento de imágenes de células madres incubadas en placas con la base de plástico

Las placas de cultivo con la base de vidrio, que se usan para la observación de fluorescencia de células vivas, son comercializadas por muchos fabricantes de cámaras de incubación. Sin embargo, algunos tipos de células no pueden cultivarse correctamente en una superficie de vidrio y requieren el uso de placas con base de plástico.
Algunos tipos de células madre, como las células madre pluripotentes inducidas (iPS) y las células madre embrionarias (ES), pueden diferenciarse mejor en las células objetivo cuando se cultivan en un sustrato de plástico. De hecho, algunos tipos de células no pueden diferenciarse en células objetivo cuando se incuban en placas con la base de vidrio. Sin embargo, el inconveniente con las placas dotas de una base de plástico es que el procesamiento de imágenes de fluorescencia suele ser complejo, debido a la autofluorescencia producida por el material de plástico, lo que genera un alto grado de señal de fondo. Cuando esto ocurre, la relación señal-ruido se ve afectada y resulta más complicado procesar las muestras fluorescentes.
Los investigadores de células madre desearían llevar a cabo observaciones de fluorescencia vívidas a la vez que se usan las placas con la base de plástico. En respuesta a esta necesidad, Olympus ha desarrollado una lente de objetivo con contraste de fases y alta apertura numérica (A. N.) de 20X [UCPLFLN20XPH]; esta apertura numérica ha sido mejorada de forma considerable en comparación con una lente de objetivo de contraste de fases convencional de 20X. La apertura numérica mejorada optimiza a su vez la relación señal-ruido que permite un procesamiento de imágenes de fluorescencia mejorado con placas dotadas de una base de plástico. Como resultado, los investigadores pueden observar el proceso de diferenciación de células madre de forma más efectiva mediante el procesamiento de imágenes de fluorescencia a intervalos, y evaluar de forma sencilla la confluencia de la tasa de transfección de las células cultivadas en placas dotadas de una base de plástico.
En esta nota de aplicación, se demuestra cómo la lente de objetivo con contraste de fases y alta apertura numérica de 20X de Olympus permite llevar a cabo observaciones de contraste de fases y fluorescencia vívidas en células madre, ubicadas en placas con una base de plástico; además, se proporciona un ejemplo del procesamiento de imágenes de bioluminiscencia usando la misma lente de objetivo.

Aplicación: Observación de fluorescencia y contraste de fases usando las lentes de objetivo de contraste de fases y alta apertura numérica de 20X de Olympus.

Las células madre embrionarias (ES) de ratón marcadas con GFP (GFP-H2B) en los núcleos se incubaron en placas dotadas de una base de plástico. Estas células se procesaron con una lente de objetivo dotada de un contraste de fases convencional (A. N. = 0,4) de 20X; después, fueron comparadas con imágenes capturadas con la lente de objetivo dotada de un contraste de fases y alta apertura numérica (A. N. = 0,7) de 20X.

Células ES de ratón expresada en GFP-H2B

En la comparación de las imágenes anteriores, las imágenes de fluorescencia brillante fueron adquiridas con la lente de objetivo dotada del contraste de fases y la alta apertura numérica de 20X (UCPLFLN20XPH) a fin de observar fácilmente los núcleos. Esto se debe a que los objetivos cuentan con una apertura numérica mejorada a la vez que conservan una distancia de trabajo larga (D. T. = de 0,8 a 1,8 mm).
Estas imágenes demuestran que las imágenes de fluorescencia comparables a las obtenidas usando placas con la base de vidrio pueden adquirirse con el objetivo UCPLFLN20XPH. Con la ayuda de un collar de corrección, es posible corregir fácilmente la aberración esférica que se genera por las diferencias en el espesor de la base de la placa de plástico.

Condiciones fotográficas:
Muestra: Células ES de ratón
Marcado de fluorescencia: GFP-H2B
Cámara de incubación: Placa con la base de plástico
Lente de objetivo: Lente de objetivo con contraste de fases de alta A. N. UCPLFLN20XPH
Cámara CCD: Cámara microscópica digital DP80
Microscopio invertido de investigación IX73

Aplicación: Aumento de la sensibilidad de fluorescencia de la cámara microscópica digital CCD DP80 usando el modo CCD monocromático

Tal y como se ha descrito anteriormente, la lente de objetivo con contraste de fases y alta apertura numérica de 20X de Olympus (UCPLFLN20XPH) facilitó la observación de células incubadas en una placa con la base de plástico gracias a un contraste de fases y fluorescencia vívida. Sin embargo, al retirar de forma repetida una placa de la incubadora con la intención de verificar la fluorescencia de la muestra durante los experimentos, es necesario minimizar la fototoxicidad producida por la luz de excitación. En este caso, la utilización de una cámara CCD de alta sensibilidad puede disminuir la intensidad de la luz de excitación y reducir la duración de exposición de la muestra a luz potencialmente citotóxica.
La cámara microscópica digital DP80 de Olympus ofrece la reproducibilidad del color y el procesamiento de imágenes CCD monocromático de alta sensibilidad. Al emplear el modo CCD monocromático de la cámara DP80 junto con la lente de objetivo dotada del contraste de fases y alta apertura numérica de 20X (UCPLFLN20XPH), la expresión de la GFP del Nanog (elemento central) en las células iPS de ratón pudo detectarse con eficacia a una intensidad inferior de luz, como puede verse en las siguientes imágenes.

Células iPS de ratón con expresión de la GFP del Nanog

Condiciones fotográficas:
Muestra: Células IPS de ratón
Marcado de fluorescencia: GFP del Nanog
Cámara de incubación: Placa con la base de plástico
Lente de objetivo: Lente de objetivo con contraste de fases y alta apertura numérica (UCPLFLN20XPH)
Cámara CCD: Cámara microscópica digital DP80
Microscopio invertido de investigación IX73

Aplicación: Procesamiento de imágenes de bioluminiscencia con alto rendimiento

La lente de objetivo con contraste de fases y alta apertura numérica de 20X (UCPLFLN20XPH) de Olympus alcanza un excelente rendimiento para aplicaciones exigentes como el procesamiento de imágenes de bioluminiscencia con placas dotadas de una base de plástico. El procesamiento de imágenes de bioluminiscencia permite al usuario detectar cuantitativamente la expresión genética a nivel de una única célula. Este modo de procesamiento de imágenes puede ejecutarse fácilmente con el modelo LV200 de Olympus: un microscopio diseñado específicamente para el procesamiento de imágenes de bioluminiscencia. Si se utiliza el objetivo UCPLFLN20XPH con el microscopio LV200, podrá observar varias células en un único campo. Tal y como puede verse en la imagen a continuación, la bioluminiscencia de la luciferina (amarillo) de Nanog y el contraste de fases pueden observarse con facilidad en células ES de ratón dotadas de alta sensibilidad, al nivel de una única célula.

Condiciones fotográficas:
Muestra: Células ES de ratón
Fotoluminiscencia: Luciferina del Nanog
Cámara de incubación: Placa con la base de plástico
Lente de objetivo: Lente de objetivo con contraste de fases y alta apertura numérica (UCPLFLN20XPH)
Microscopio: Sistema de procesamiento de imágenes de bioluminiscencia LV200

Conclusión

Los ejemplos descritos muestran que el objetivo dotado de un contraste de fases y alta apertura numérica de 20X (UCPLFLN20XPH) de Olympus permite procesar imágenes con métodos de bioluminiscencia, contraste de fases y fluorescencia vívida en células cultivadas dentro de placas con una base de plástico. La lente del objetivo UCPLFLN20XPH es compatible con el compensador de deriva X IX3-ZDC2 y los microscopios de investigación invertidos y motorizados de la serie IX3. Cuando el sistema está equipado con una platina motorizada, es posible configurarlo fácilmente para un ensayo celular completamente motorizado con placas dotadas de una base de plástico.