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Nota de aplicación

Uso de la microscopía multifotónica intravital para visualizar interacciones dinámicas entre neutrófilos y monocitos/macrófagos en las vías respiratorias de un ratón infectado con influenza


El sistema inmunológico innato del cuerpo es la primera línea de defensa contra la infección viral. Una de sus principales funciones es el reclutamiento de varios tipos de glóbulos blancos, o leucocitos, a los sitios de infección (p. ej., las vías respiratorias). Todos estos leucocitos, incluidos los neutrófilos y los monocitos/macrófagos, actúan en coordinación para fortalecer las defensas del cuerpo contra el virus. Fomentar una comprensión más profunda de los mecanismos de este proceso inmunológico innato ayudará a los investigadores a desarrollar y mejorar la eficacia de las vacunas y las terapias.

En esta nota de aplicación, el Dr. Minsoo Kim y sus colegas examinaron la dinámica de los neutrófilos y monocitos/macrófagos in vivo en la tráquea de un ratón infectado con influenza usando la microscopía multifotónica intravital. La observación 3D y el análisis de las imágenes revelaron patrones de motilidad que no habían sido reconocidos antes en las interacciones entre neutrófilos y monocitos/macrófagos.

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La reconstrucción 3D de imágenes muestra la migración de neutrófilos en la tráquea del ratón infectado por la influenza. Rojo: neutrófilo. Blanco: vaso sanguíneo. Barra de escala: 50 μm. La fluorescencia de la proteína tdTomato se excitó a 975 nm y se detectó en el canal rojo (de 575 a 630 nm). La fluorescencia de Alexa Fluor 647 se excitó a 1200 nm y se detectó en el canal rojo lejano (de 645 a 685 nm). Datos adaptados de la Referencia bibliográfica [1].

Migración de neutrófilos en la tráquea del ratón infectado por influenza

Para observar los neutrófilos en la tráquea del ratón infectado con influenza, se infectaron ratones Ly6GCre/ROSAtdTomato con el virus de la influenza. Entre los tres y seis días posteriores a la infección, hubo una infiltración transitoria masiva de neutrófilos y monocitos en la tráquea. Para marcar los vasos sanguíneos, se inyectó por vía intravenosa el anticuerpo CD31 conjugado con la proteína Alexa Fluor 647 a los ratones antes del procesamiento de las imágenes. La microscopía multifotónica intravital se produjo en la tráquea canulada quirúrgicamente de los ratones anestesiados. Tal y como se muestra en el primer video (Video 1), se observó tanto los neutrófilos de tdTomato (rojo) como los vasos sanguíneos (blanco) y la migración de neutrófilos alrededor de los vasos sanguíneos vecinos en la tráquea del ratón infectado con influenza.

Patrones de motilidad entre las interacciones de neutrófilos y monocitos/macrófagos

Para observar tanto los neutrófilos como los monocitos/macrófagos en la tráquea del ratón infectado con influenza, se infectaron ratones de Ly6G-Cre, ROSA-tdTomato y Csf1r-EGFP con el virus de la influenza. Los neutrófilos expresaron tanto la proteína GFP como la tdTomato (observación de fluorescencia roja/naranja) mientras que los monocitos/macrófagos expresaron solo la proteína GFP (observación de fluorescencia verde). Como se muestra en el segundo video (Video 2), los neutrófilos de GFP/tdTomato (rojo/naranja), los monocitos/macrófagos de GFP (verde) y los vasos sanguíneos (blanco) fueron observados en la tráquea del ratón infectado con influenza. En el quinto día después de la infección, la mayoría de los monocitos/macrófagos se inmovilizaron, mientras que la mayoría de los neutrófilos permanecieron altamente activos y se movieron constantemente muy cerca de los monocitos/macrófagos circundantes.

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Migración e interacciones de neutrófilos y monocitos/macrófagos en la tráquea del ratón infectado por influenza. Rojo/naranja: neutrófilos. Verde: monocitos/macrófagos. Blanco: vaso sanguíneo. Barra de escala: 50 μm. Tanto la fluorescencia de la proteína GFP como la de tdTomato se excitaron a 975 nm y fueron detectadas posteriormente en el canal verde (495–540 nm) y el canal rojo (575–630 nm), respectivamente. La fluorescencia de Alexa Fluor 647 se excitó a 1200 nm y se detectó en el canal rojo lejano (de 645 a 685 nm). Datos adaptados de la Referencia bibliográfica [1].

Al observar con más detalle,usando una magnificación superior, se revelaron más datos en el patrón de interacción entre neutrófilos y monocitos/macrófagos. El tercer video (Video 3) muestra la reconstrucción 3D de la migración de neutrófilos entre los monocitos/macrófagos en la tráquea del ratón durante el sexto día después de la infección. Este video muestra que los neutrófilos en amplio movimiento (rojo) se encontraron activos y fueron hacia los monocitos/macrófagos circundantes no migratorios (verde). Los encuentros frecuentes llevaron a la absorción de los neutrófilos por los monocitos/macrófagos, lo que indica el mecanismo de eliminación de los neutrófilos moribundos de la tráquea infectada.

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La reconstrucción 3D de las imágenes muestra interacciones detalladas entre neutrófilos y monocitos/macrófagos en la tráquea del ratón infectado por influenza (sexto día después de la infección). Rojo: neutrófilo. Verde: monocitos/macrófagos. Tanto la fluorescencia de la proteína GFP como la de tdTomato se excitaron a 975 nm y fueron detectadas posteriormente en el canal verde (495–540 nm) y el canal rojo (575–630 nm), respectivamente. Datos adaptados de la Referencia bibliográfica [1].


¿Cómo el microscopio multifotón FVMPE-RS facilitó este experimento?

Sistema de láser doble FVMPE-RS para el procesamiento multifotónico de imágenes con múltiples longitudes de ondas simultáneas

El microscopio multifotón FVMPE-RS soporta dos láseres de excitación multifotónica independientes para asegurar un procesamiento multifotónico de imágenes con múltiples longitudes de ondas simultáneas. Las óptimas longitudes de las ondas de excitación pueden usarse al mismo tiempo para cada fluorocromo sin tener que sintonizar repetidamente el láser. El control de potencia independiente de cada láser permite la adquisición de imágenes equilibradas a partir de diferentes fluorocromos.

Sistema de láseres duales FVMPE-RS

Sistema de microscopio con estativo puente para el procesamiento de imágenes de ratones in vivo

El estativo puente ofrece un alto grado de flexibilidad para adaptarse a diferentes muestras. El gran espacio para la muestra en la parte inferior del microscopio (640 × 520 × 350 mm) es ideal para un procesamiento de imágenes in vivo/intravital de animales pequeños, así como para incorporarlo en configuraciones caseras destinadas a dichos experimentos.

Estativo puente

Objetivo dedicado de excitación multifotónica XLPLN25XWMP2

Los objetivos dedicados a la excitación multifotónica están optimizados para la obtención de imágenes multifotónicas en la profundidad del tejido.  El revestimiento óptico ofrece una buena transmisión de 400 nm a 1600 nm para garantizar una excitación eficiente del infrarrojo cercano y una recogida visible de la fluorescencia. El objetivo de inmersión en agua XLPLN25XWMP2 de Olympus tiene una alta apertura numérica (A. N.: 1,05), una larga distancia de trabajo (2,0 mm) y un amplio campo de visión (A. N.: 18 mm); todos en conjunto brindan un excelente rendimiento en el procesamiento  multifotónico de imágenes in vivo/intravitales. Curva de transmitancia del objetivo

Biografía del Dr. Minsoo Kim

Dr. Minsoo Kim es profesor decano de microbiología e inmunología y director del programa de Investigación de Inmunoterapia Tumoral en el Instituto Oncológico Wilmot, y miembro del Centro David H. Smith dedicado a la Biología e Inmunología de las Vacunas. Sus intereses de investigación cubren el área de las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas, como también la inmunoterapia contra el cáncer. Es reconocido de forma especial por sus contribuciones pioneras en el desarrollo de técnicas avanzadas para el procesamiento de imágenes que permiten una observación en tiempo real y el control de las respuestas inmunitarias dinámicas tanto en células vivas como en modelos de animales vivos.

Minsoo Kim

Agradecimientos

Esta nota de aplicación fue preparada con la colaboración de los Dres. Minsoo Kim y Kihong Lim del Departamento de Microbiología e Inmunología, Centro David H. Smith dedicado a la Biología e Inmunología de las Vacunas, Universidad de Rochester, NY, EE. UU.

Referencia

[1] Kihong Lim, Tae-hyoun Kim, Alissa Trzeciak, Andrea Amitrano, Emma Reilly, Hen Prizant, Deborah Fowell, David Topham y Minsoo Kim. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. [¿Cómo la eferocitosis de neutrófilos in situ crea la inmunidad de las células T a la infección por influenza]. Nature Immunology 21, 1046-1057 (2020).

Productos usados para esta aplicación

Microscopio de escaneo láser multifotón

FVMPE-RS

  • Resolución y contraste maximizados con objetivos TruResolution
  • Creación de imágenes a alta velocidad con escáner resonante
  • Excitación multifotón en IR extendido hasta 1300 nm
  • Opción de triple escáner para estimulación multifotón y por láser visible
  • Transmisión altamente eficiente con 1600 capas ópticas en objetivos dedicados a multifotones y unidad de escaneo
  • Alineación automática en 4 ejes de los haces láser IR
Objetivos dedicados a la excitación multifotón (MPE)

XLPLN-MP/XLSLPLN-MP

  • Optimización para el procesamiento de imágenes multifotón.
  • Procesamiento de imágenes 3D de alta resolución mediante la detección de fluorescencia desde el punto focal de un gran campo visual.

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