Observación de las estructuras neuronales entre la corteza y el tálamo en el cerebro de un tamarino con FLUOVIEW FV3000

La corteza prefrontal (PFC) presenta un incremento del tamaño desproporcionado en los humanos, y es responsable de funciones cognitivas y ejecutivas avanzadas. Su disfunción puede causar desórdenes psiquiátricos como la esquizofrenia y el Alzheimer. La PFC ha sido estudiada activamente en ratones; sin embargo, estos carecen de una región equivalente a la corteza granular frontal, lo que evidencia una gran diferencia estructural frente a la de los primates. Por consiguiente, la investigación a partir de modelos de primates es importante para relacionar los estudios efectuados con ratones y humanos. Nuestro grupo de investigación utiliza como modelo a los tamarinos: pequeños primates de la familia de los callitrícidos que habitan en América Central y Sudamérica.

En este experimento, se investigan las interacciones entre la PFC y el núcleo reticular del tálamo (TRN): un grupo de neuronas inhibitorias que circundan el tálamo. El TRN actúa como una vía de entrada que controla la transmisión de información desde la corteza cerebral hacia el tálamo. Se ha investigado la morfología detallada de las fibras axonales en el TRN que viajan desde la PFC hasta el tálamo.

Figura 1. Diagrama que muestra cómo los axones neurales ingresan al tálamo desde la corteza prefrontal a través del núcleo reticular del tálamo. El núcleo reticular del tálamo actúa como una vía de entrada al tálamo.

Procesamiento de imágenes de nivel macro a micro mediante
una distribución simple del trabajo

Las fibras axonales que se originan en la PFC pasan a través de un corredor llamado «cápsula interna», como una banda gruesa. Este haz axonal ingresa al tálamo por la parte anterior del TRN, donde revela morfologías complejas al dividirse y reorientarse. Para identificar con precisión el TRN, se usó como marcador la parvalbúmina (PV) [Fig. 1].

La función de macro a micro del microscopio confocal de escaneo láser FLUOVIEW FV3000 conecta perfectamente las vistas macro y micro en el procesamiento de imágenes confocal. Se usó esta función para obtener una imagen sinóptica de baja magnificación a partir de las fibras axonales de la PFC que pasan por las células PV positivas; y, luego, se cambió a la alta magnificación para observar la ramificación de las fibras axonales finas y las terminaciones nerviosas (o botones terminales).

En la observación de alta magnificación, se usó un objetivo de inmersión en aceite de silicona a fin de observar detalladamente la parte más profunda de la muestra en alta resolución. Con una magnificación baja, sólo se pudieron observar las fibras axonales gruesas que pasan a través del TRN. Mediante un objetivo de inmersión en aceite de silicona de 40X, se pudo observar que dichas fibras axonales revelaban una fina ramificación y decoración originada por las innumerables estructuras granulares de tipo botón (Fig. 2).

Figura 2. Uso de la función macro a micro para representar el punto donde las fibras axonales se encuentran con el TRN, en dirección hacia el tálamo a partir de la PFC del cerebro de un tamarino (callitrícido). Dado que las neuronas TRN están compuestas de neuronas inhibitorias positivas para la parvalbúmina (PV), es posible identificarlas por los anticuerpos anti-PV (rojo). El verde indica terminales axonales de la corteza cerebral, y el cian indica núcleos.

Condiciones de procesamiento de imágenes
Microscopio: Microscopio confocal de escaneo láser FLUOVIEW™ FV3000
Láser: 405 nm (DAPI, cian); 488 nm (GFP, verde); 561 nm ( parvalbúmina, rojo)

a. Objetivo: PLAPON1.25X; aplicación mosaico: 3 × 3; barra de escala: 3000 μm
b. Objetivo: UPLXAPO10X; aplicación mosaico: 2 × 2; barra de escala: 300 μm
c. Objetivo: UPLSAPO40XS; aplicación mosaico: 2 × 2, 73 diapositivas; barra de escala: 30 μm (sólo se muestra el color verde y rojo)

Observación 3D en alta resolución de la estructura fina de las fibras axonales

Se capturó una imagen bajo apilamiento en Z usando un objetivo de inmersión en silicona de 100X para la reconstrucción tridimensional (Fig. 3). Gracias a ella, se pudieron observar las estructuras tridimensionales detalladas de los gránulos de tipo botón que circundan las neuronas TRN.

Comentario del Dr. Watakabe

En este experimento, se necesitaba alternar entre un objetivo de baja magnificación y un objetivo de alta magnificación. La función de representación de nivel macro a micro del microscopio FV3000 permitió esta transición sin problemas, y nos permitió explorar la imagen sinóptica del cerebro, a la vez que capturaba la estructura fina con alta magnificación. El uso de un objetivo de inmersión en aceite de silicona nos ayudó a observar la fina morfología de las terminaciones nerviosas (o botones terminales).

Investigación preliminar

Esta investigación se llevó a cabo como parte del proyecto «Brain Mapping by Integrated Neurotechnologies for Disease Studies» (Cartografía cerebral por neurotecnologías integradas para el estudio de enfermedades) [Brain/MINDS]. Este proyecto tiene como objetivo ampliar el conocimiento sobre los trastornos psiquiátricos y neurológicos humanos y, con el tiempo, superarlos mediante el examen de los circuitos neuronales del modelo primate. El Dr. Watakabe forma parte de un grupo de investigación encargado de cartografiar las estructuras cerebrales de los tamarinos, centrándose esencialmente en las conexiones de la corteza prefrontal (PFC).

Documentos relacionados:
Okano, H., Sasaki, E., Yamamori, T., Iriki, A., Shimogori, T., Yamaguchi, Y., Kasai, K., Miyawaki, A. «Brain/MINDS» Neuron., 2016, 2 de noviembre; 92(3):582-590. doi:10.1016/j.neuron.2016.10.018.

¿Cómo el microscopio confocal de escaneo láser FV3000 ha respaldo
el experimento?

Objetivos de inmersión en aceite de silicona: Imágenes brillantes en muestras de tejido grueso

La gama de objetivos de inmersión en aceite de silicona de alto rendimiento de Olympus ha favorecido la observación de tejidos profundos en alta resolución a partir de muestras transparentes. Puesto que el índice de refracción del aceite de silicona (en torno a 1,40) se aproxima al índice de refracción del tejido vivo (en torno a 1,38), estos objetivos previenen la aberración esférica causada por la variación del índice de refracción, lo que permite la adquisición 3D de estructuras tisulares con alta definición.