Al tomar en consideración las limitaciones de tiempo que acatan las instituciones de investigación para las actividades presenciales en laboratorio en virtud del distanciamiento social y la salud del personal, nunca ha sido tan importante contar con la capacidad para automatizar y optimizar las tareas asociadas al procesamiento de imágenes de células vivas con el objetivo de permanecer productivos.

Sin embargo, existen muchos aspectos que deben considerarse a fin de optimizar su equipamiento y evitar escenarios inesperados que podrían requerir un reingreso al laboratorio.

A continuación, se proporcionan cuatro consejos:

1. Mantener sanas las muestras en un ambiente temperado y estable

Uno de los mayores desafíos durante el procesamiento de imágenes de células vivas es mantener sanas las muestras —cuando se encuentran fuera de su temperada y cómoda incubadora— y un comportamiento estable de la platina del microscopio.

Si bien esto puede plantear un desafío, es posible mantener sus muestras lo más cómodas posible si usa incubadoras superiores de platina o incubadoras cerradas dedicadas a microscopios para proporcionar la temperatura, humedad y densidad de CO2 estables que requieren las células.

Asimismo, no olvide entibiar su objetivo; ya que, el contacto de este dispositivo, que normalmente es frío, con las muestras podría dañarlas.

Recuerde además que la región periférica de las microplacas es más propensa a una fluctuación ambiental que la región central; por ende, asegúrese de usar los pocillos centrales y evitar los pocillos ubicados en el contorno/borde para mejorar la estabilidad. Por ejemplo, si utiliza una placa de 96 pocillos (12 × 8 pocillos), utilice solo los 60 pocillos centrales (10 × 6 pocillos) para el experimento.

Figura 1. Incubadora superior de platina

2. Favorecer una temperatura ambiente estable para mejorar el enfoque

Otro aspecto a tener en cuenta es la temperatura ambiente, ya que una pequeña variación puede afectar el rendimiento de la imagen.

La estabilidad de la temperatura ambiente para su microscopio es vital, en especial, al observar células vivas bajo una alta magnificación. Debido a que la observación con una alta apertura numérica presenta una profundidad de campo menos profunda, el cambio de temperatura relevado hasta en una pequeña deriva en Z puede generar la pérdida del enfoque de su sistema.

Para optimizar el entorno experimental, asegúrese de que su sistema de aire acondicionado esté funcionando correctamente y que la temperatura ambiente sea estable antes de comenzar el experimento. También, evite flujos de aire directos en el microscopio, que puedan provenir del aire acondicionado, para así optimizar la estabilidad.

3. Determinar con precisión el enfoque y el collar de corrección a fin de mejorar la calidad de imagen

Otra forma de abordar la fluctuación temporal, como la deriva en Z, es iniciar el proceso experimental de células vivas mediante la configuración del enfoque y la corrección del collar con la mayor precisión posible.

A menudo, los investigadores ajustan el enfoque minuciosamente; pero, olvidan el collar de corrección. No obstante, el collar de corrección es capaz de mejorar considerablemente la calidad de la imagen, en especial durante la observación de tejidos profundos o al usar un objetivo de apertura numérica alta.

La posición ideal del collar de corrección depende de muchos factores, como el índice de refracción de la muestra, la profundidad del plano de observación y el espesor del cubreobjetos. Además y aunque la mayoría de los cubreobjetos y placas de vidrio se dotan de un espesor de 170 µm (#1.5), este valor puede fluctuar y, lo que es más importante, no puede asumirse en el caso de los recipientes de plástico.

Por dicha razón, ajuste siempre el collar de corrección con precisión y compruebe el contraste de la imagen, en especial al utilizar placas o microplacas de plástico.

Por lo general, la corrección del collar debe efectuarse in situ. En el caso de experimentos que requieren ajustes dinámicos de corrección del collar, como la observación profunda con un microscopio multifotónico, se suele pasar más tiempo en el laboratorio. La buena noticia es que los ajustes pueden ser automatizados empleando un collar de corrección motorizado.

Figura 2. Collar de corrección en un objetivo con el indicador de espesor para los cubreobjetos.

Obtenga más información sobre los sistemas de lentes motorizados para imágenes profundas al consultar la publicación de blog: ¿Cómo mejorar el procesamiento de imágenes profundas en la microscopía multifotón?

4. Utilizar un módulo de enfoque específico para mantener las muestras enfocadas

¿Qué sucede en el caso de una deriva en Z?

Incluso al seguir todos los consejos anteriores, es posible que su imagen no siempre permanezca enfocada. Después de todo, muchos factores pueden causar una deriva en Z. Puede ocurrir por un cambio dinámico e intencional como al agregar regentes, así como por vibraciones físicas debido a alguien caminando en la habitación o a un cambio en la temperatura ambiente.

Y, aunque la mayoría de los microscopios motorizados contienen una función de enfoque automático, basada en el contraste de la imagen, existen limitaciones:

• Capacidad limitada en el rango de ajuste.
• Luz de excitación, dedicada al enfoque por contraste, que causa fototoxicidad.

Una forma de asegurar el enfoque durante los experimentos de células vivas es utilizando un módulo de enfoque específico, como el compensador de deriva en Z TruFocus de Olympus, que se basa en el láser infrarrojo cercano (NIR). La luz NIR también permite minimizar la fototoxicidad y las señales cruzadas en la longitud de onda de la imagen durante una observación prolongada.

Mientras el modo de enfoque automático (AF) del módulo, a una sola toma, evita la iluminación innecesaria, el modo AF continuo también sirve para un observación en vivo o adquisición continua de imágenes con respecto a fenómenos rápidos.

Figura 3. Mantener las muestras bajo un enfoque nítido con el compensador de deriva en Z TruFocus de Olympus

A través del siguiente video, podrá ver el funcionamiento de la compensación de deriva en Z para asegurar procesamientos de imágenes sólidos:

Permanecer productivo ejecutando experimentos eficientes de células vivas

Siempre hay trabajo por hacer; por ende, se espera que estos consejos le ayuden a mantenerse productivo, a lograr imágenes de células vivas por más tiempo y a continuar con sus investigaciones científicas. No dude en contactarnos si tiene preguntas sobre cómo automatizar su laboratorio. ¡Estamos a su disposición!

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