El procesamiento de imágenes de células vivas por fluorescencia puede ser complicado, ya que se deben obtener imágenes de alta calidad sin afectar la viabilidad celular. No obstante, mediante técnicas y herramientas de microscopía adecuadas, es posible llevar a cabo un experimento exitoso y obtener datos de imágenes fiables.

A través de esta publicación, se proporcionan seis consejos para obtener buenos resultados en el procesamiento de imágenes de células vivas por fluorescencia.

1. Encuentre el microscopio adecuado para sus necesidades de procesamiento de imágenes.

En lo que respecta al procesamiento de imágenes de células vivas, no todos los microscopios se han diseñado igual. Por ejemplo, los microscopios invertidos funcionan bien para el procesamiento de imágenes de células vivas porque permiten una observación por debajo de la muestra. Esto permite que la lente del objetivo se acerque más a la muestra viva, lo cual es necesario con la mayoría de lentes de objetivo de alta apertura numérica (A. N.).

2. Utilice placas de cultivo con la base de vidrio en el cubreobjetos.

Las placas con base de plástico pueden provocar autofluorescencia y degradar la relación entre señal y ruido (relación S/N). Por ello, es importante usar placas de cultivo con la base de vidrio en el cubreobjetos siempre que sea posible durante los experimentos de procesamiento de imágenes por fluorescencia con células vivas.

3. Utilice filtros de fluorescencia con altos índices emisión para mejorar la relación S/N. Uno de los componentes de hardware más importantes para los experimentos de procesamiento de imágenes por fluorescencia de células vivas es el cubo portafiltros (y los filtros que contiene). Busque filtros con altos índices de transmisión para poder recoger la máxima señal de fluorescencia posible. Esto acortará los tiempos de exposición y, de esta forma, reducirá el fotoblanqueo y la fototoxicidad. Los cubos portafiltros de Olympus tienen un revestimiento especial que reduce la cantidad de luz dispersa dentro del cubo y mejora la relación S/N de las imágenes finales.

Cubo portafiltros de Olympus

4. Utilice lentes de objetivo con una alta A. N. para recoger más luz y reducir los tiempos de exposición.

Otra forma posible para reducir los tiempos de exposición es a través del uso de objetivos con una alta A. N. Estos objetivos recogen más luz que sus semejantes con una A. N. baja dotada de la misma magnificación. Esto permite reducir aún más los tiempos de exposición y mejora la salud celular durante los experimentos a largo plazo al usar células vivas con fluorescencia.

Objetivo de aceite de 40X de la serie X Line de Olympus

5. Optimice los modelos de incubación para sus necesidades experimentales.

Actualmente en el mercado, existen muchos modelos de incubadoras para la microscopía. Tanto si utiliza la parte superior de la platina como toda la unidad del microscopio, es importante comprobar que la incubadora cumpla con todas las necesidades de sus células vivas, como proporcionar la humedad apropiada y mantener los niveles correctos de concentración de gases.

Algunas incubadoras albergan paneles limitadores que impiden que el microscopio recoja la luz de la sala, lo cual mejora la relación S/N.

6. Utilice dispositivos de mantenimiento de enfoque para reducir la cantidad de estativos en Z que ayudan a conseguir la posición focal correcta.

Dado que las muestras vivas se mueven, es importante asegurarse de que el enfoque pueda ser copiado durante los experimentos a intervalos de tiempo.

En lugar de exponer sus muestras a diversas iluminaciones por franja de tiempo a través del apilamiento en Z, utilice un dispositivo de compensación de deriva, como nuestro módulo de compensación de deriva Z TruFocus para poder mantener el enfoque durante los experimentos de intervalo de tiempo.

Compensador de deriva Z TruFocus de Olympus

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