Desde la primera observación de células divididas en forma de cubo bajo la lente casera de Robert Hooke, hasta la investigación de Osamu Shimomura relativa a la aequorina y GFP de medusas, pasando por las novedosas moléculas de tinción intermitente de Xiaowei Zhuang durante la reconstrucción 3D de súper resolución, nunca se ha dejado de explorar el microcosmos de la vida con la microscopía óptica.
Como sostén principal de la cuarta revolución industrial, la ingeniería de la nanotecnología ha florecido en el siglo XXI, inicialmente en aplicaciones de la ciencia de los materiales. Cuando la nanotecnología se encontró con las ciencias de la vida, provocó un nuevo destello que ilumino el microcosmos de la vida con la luz de los nanomateriales: las nanosondas fluorescentes.
El despertar de la microscopía a fluorescencia
La fluorescencia es un tipo de fotoluminiscencia y se produce por absorción de luz. Existen numerosos fenómenos fluorescentes en la naturaleza. La proteína verde fluorescente (GFP) extraída de medusas luminiscentes fue la primera aplicación práctica de este fenómeno para explorar el mundo microscópico vivo. A principios de los años 90, los investigadores revelaron que el uso del gen GFP en otros organismos vivos para su expresión haría que los organismos que no emitiesen fluorescencia de forma natural produzcan fluorescencia verde. Desde entonces, los científicos han mejorado aún más los colores disponibles, la intensidad de la luz, la estabilidad y otras propiedades de la proteína verde fluorescente (GFP) mediante el análisis de su estructura y mecanismos, lo cual ha abierto paso a un enorme desarrollo y a la aplicación de proteínas fluorescentes (FP) en el procesamiento de imágenes biológicas (Figura 1).
Figura 1. Procesamiento de imágenes a fluorescencia multicolor a partir del intestino posterior de una larva de Drosophila, en el que el amarillo marca la actina F, el verde marca los núcleos y la tabla de búsqueda intensitométrica (LUT, por sus siglas en inglés) marca las gotitas de lípidos.
Si bien la familia de proteínas fluorescentes aumenta cada vez más, su ámbito de aplicación es aún limitado. El espectro de emisión de las proteínas fluorescentes (FP) es amplio y asimétrico, lo que da como resultado frecuentes interferencias en el procesamiento de imágenes simultáneo a partir de múltiples canales. Con la ayuda de la síntesis química, surgieron colorantes orgánicos de rica variedad y fácil operación, que no sólo ampliaron en gran medida el alcance de la aplicación de imágenes fluorescentes, sino que también facilitaron la producción comercial estándar. Esto permitió formar una base sólida para un salto adelante en materia de desarrollo.
Nanomateriales como avance para el procesamiento de imágenes biológicas
De forma gradual, ciertas desventajas de los colorantes orgánicos, como la fluorescencia y la fotoestabilidad deficientes, se convirtieron en obstáculos en la progresión del procesamiento de imágenes de fluorescencia. Afortunadamente, gracias a las propiedades ópticas especiales inherentes, la síntesis direccional y el ensamblaje, así como a otras ventajas, los nanomateriales están dispensando un nueva capacidad al procesamiento de imágenes de fluorescencia. En la actualidad, entre los nanomateriales fluorescentes comunes destacan los siguientes (Figura 2):
- Puntos cuánticos semiconductores (QD);
- Materiales de tierras raras de conversión ascendente (nanopartículas de conversión ascendente, UCNP);
- Nanopartículas de metales nobles (específicamente, AuNP).
Frente a otros colorantes, los nanomateriales fluorescentes brindan las ventajas de un alto rendimiento cuántico, alta estabilidad, gran Cambio de Stokes, amplio espectro de excitación y estrecho espectro de emisión. Las longitudes de onda de emisión de estos nanomateriales cambian en función del ajuste aplicado a su tamaño. Su biocompatibilidad, además de las funciones de reconocimiento y detección, pueden mejorarse a través del ensamblaje y las modificaciones ejecutadas. En resumen, los nanomateriales ofrecen un excelente potencial para el marcado fluorescente, así como para el futuro del procesamiento de imágenes fluorescentes.
Figura 2. Ejemplos ilustrados de nanopartículas orgánicas e inorgánicas, en los que se representa el tamaño, las formas y los materiales.
Flujo de trabajo básico para nanosondas fluorescentes
Puesto que se trata de un proceso interdisciplinario que involucra la nanoquímica y el procesamiento de imágenes biológicas, la distribución del trabajo para diseñar nanosondas fluorescentes es diferente a la del procesamiento tradicional de imágenes biológicas. Es un proceso de múltiples pasos que cubre cálculo teórico, síntesis química, procesamiento de imágenes, e incluso ensayos médicos (Figura 3).
Figura 3. Flujo de trabajo básico para nanosondas fluorescentes
Los procesos de investigación que usan nanosondas fluorescentes están correlacionados en su mayoría a su aplicación. El procesamiento de imágenes biológicas con ayuda de nanosondas fluorescentes cubre desde muestras in vitro hasta imágenes dinámicas in vivo, e incluso puede desarrollarse en el ámbito de diagnósticos y estudios médicos. Por lo tanto, la aplicación biológica es tomada en consideración cuando se trata de diseñar una nanosonda; por su parte, los nanomateriales dotados de propiedades ópticas especiales u otras funciones (p. ej., infrarrojo cercano, conversión ascendente, física de dos fotones, etc.) son seleccionados en conformidad con las necesidades específicas de las aplicaciones biológicas para luego ser sintetizados y caracterizados a fin de detectar nanomateriales de alta calidad. A continuación, las sondas son modificadas y ensambladas (Figura 4) considerando la biocompatibilidad o los requisitos de sus funciones, como la manipulación óptica, la carga de fármacos/medicamentos, el reconocimiento molecular, etc.
Figura 4. Representación 3D de nanosondas de oro (GNP) funcionalizadas y revestidas con proteínas fluorescentes verdes (GFP) y moléculas de ácido cítrico
En la investigación que involucra nanosondas fluorescentes, la microscopía óptica se aplica principalmente en tres áreas: la caracterización, el cribado de nanomateriales de alta calidad, y la detección in vivo de nanosondas. En el proceso de cribado, las características de las distintas partículas suelen ser muy variables debido a su estructura heterogénea inherente. A diferencia de los métodos tradicionales que se basan en las características de conjunto a partir de un gran número de partículas agrupadas, la microscopía óptica favorece el cribado de sondas de alta calidad a nivel de una sola partícula y una investigación más profunda en cuestión de la relación estructura-función con el fin de guiar la síntesis de su diseño. En el procesamiento de imágenes biológicas, la microscopía óptica facilita la detección de señales ópticas in vivo provenientes de nanosondas a fin de generar imágenes y rastrear sus reacciones dinámicas espaciotemporales.
Aplicaciones de investigación con nanosondas fluorescentes y soluciones de microscopía
Procesamiento de imágenes de infrarrojo cercano/conversión ascendente con la solución del NIR FV3000 Red
El procesamiento de imágenes de infrarrojo cercano es actualmente un foco de investigación en la microscopía óptica gracias a su capacidad de penetración profunda, baja fototoxicidad y baja interferencia a partir de la fluorescencia tisular autónoma. Las nanosondas fluorescentes, como los puntos cuánticos, pueden lograr fácilmente la excitación del NIR a través de ajustes de composición química, morfología y tamaño. Por otra parte, los nanomateriales de conversión ascendente poseen una propiedad óptica especial, la cual es práctica para el procesamiento de imágenes con el NIR. Estos emiten una luz de longitud de onda más corta (luz visible o ultravioleta) que la luz de excitación al ser excitados por una luz de longitud de onda larga (como el NIR). Fruto de estas ventajas, las nanosondas de conversión ascendente son consideradas biomarcadores fluorescentes de última generación, y se espera que desempeñen un papel importante en la investigación biomédica, de energía y catálisis, así como en otros campos.
Cabe resaltar que en la actualidad, la detección sensible in vivo y en tiempo real de la hepatotoxicidad representa un atasco en el diagnóstico de la lesión hepática inducida por fármacos. A través de un artículo publicado por el grupo de investigación del profesor Li Huijun en el año 2020, se expuso el diseño de una nanosonda de conversión ascendente, por ensamblaje de nanopartículas de conversión ascendente (UCNP) y nanobarras de oro (GNR), así como su aplicación para el diagnóstico in situ y en tiempo real de la lesión hepática inducida por fármacos. La novedosa nanosonda pudo ser introducida en el hígado y ser activada de forma específica por un marcador de daño hepático (miR122), que produjo imágenes de fluorescencia en 800 nm al ser excitado por el infrarrojo cercano en 980 nm. De forma combinada con la transferencia de energía por resonancia de luminiscencia (LRET) y la tecnología de amplificación de señal, la sensibilidad de detección del dispositivo se vio aumentada a fin de lograr una detección altamente sensible del miR122. Esto ha proporcionado un nuevo enfoque en el control clínico de la lesión hepática inducida por fármacos en tiempo real.[4]
A diferencia del procesamiento de imágenes confocales convencional, el procesamiento de imágenes del NIR, o de nanosondas de conversión ascendente, requiere instrumentos dotados de ciertas capacidades:
- Las longitudes de onda para la excitación, comúnmente utilizadas en la microscopía confocal convencional, son de 400 a 650 nm, mientras que en el procesamiento del infrarrojo cercano se requieren láseres de NIR que usen longitudes de onda > 700 nm.
- La mayoría de los componentes que forman la trayectoria óptica bajo el procesamiento de imágenes convencional, como el galvanómetro de escaneo, los objetivos y las redes de difracción, soportan solamente la antirreflexión/calibración en el rango visible y no pueden proporcionar la eficiencia ni la precisión que aporta el procesamiento de imágenes del NIR.
- La detección del NIR requiere detectores de NIR específicos de >750 nm.
Con el fin de satisfacer estos requisitos, el microscopio confocal láser FLUOVIEW™ FV3000 ofrece una solución para el procesamiento de imágenes del NIR (Figura 5). Por medio de un sistema reconocido, la solución FV3000 Red se especializa en el procesamiento de imágenes del NIR altamente sensibles y precisas con más colores.
Solución FV3000 Red para el procesamiento de imágenes del NIR Láser de infrarrojo cercano: Optimización del infrarrojo cercano en los componentes ópticos: Objetivos X Line: Detectores de NIR específicos: |  |
Figura 5. El sistema modular de escaneo láser confocal FLUOVIEW FV3000 ofrece la solución FV3000 Red para el procesamiento de imágenes del NIR. |
A través de esta nota de aplicación, preparada en colaboración con el Dr. Kai Li (Universidad de Ciencia y Tecnología del Sur, China), se expone el uso exitoso de la solución FV3000 Red dedicada al NIR en el procesamiento de imágenes de nanopartículas —basadas en moléculas (BTB) mediante la segunda ventana óptica (NIR-II)— en el sistema vascular de orejas, extremidades posteriores y cerebro de ratones con tumores (Figura 6).
Figura 6. Los investigadores de este estudio modificaron la superficie de la nanosonda BTB con el péptido diana de arginina-glicina-ácido aspártico (RGD). En 48 horas, se observó que el ratón, inoculado con las nanosondas BTB-RGD, mostraba un aumento significativo en la señal de fluorescencia de NIR-II en el área del tumor, a diferencia de la nanosonda BTB.
Procesamiento de imágenes in vivo de marcadores tumorales con la solución de detección profunda FVMPE-RS™
El cáncer es uno de los problemas de sanidad más graves de la sociedad. El diagnóstico temprano y la escisión precisa de los tumores malignos es una de las principales prioridades de la investigación médica actual. Tanto el diseño como el desarrollo de nanosondas fluorescentes novedosas, dedicadas a la identificación específica de marcadores tumorales y el procesamiento de imágenes in vivo de alta resolución, permiten proporcionar nuevas soluciones de detección para el diagnóstico clínico temprano de tumores malignos, como también para una escisión quirúrgica precisa.
La sobreexpresión de enzimas, como la fosfatasa alcalina (ALP), en las células tumorales es un indicador clínico importante de la aparición, el desarrollo y la progresión de los tumores. Por lo tanto, un rápido método de detección que ofrezca una alta sensibilidad a la actividad de la ALP favorecerá la detección temprana y la escisión precisa de los tumores. En el año 2020, el profesor Xiaojun Peng y su equipo publicaron un artículo sobre el uso de una nanosonda diseñada para tal fin. El documento detalla cómo se diseñó y preparó una sonda cargada con fluorógenos dotados de características AIE [AIEgen] dedicadas a procesar en imagen la actividad DQM-ALP. Esta sonda emitió una fuerte fluorescencia al ser agregada tras la interacción con la ALP sobreexpresada en células tumorales o cancerosas. La nanosonda diseñada evitó el problema de extinción de fluorescencia que se produce al agregar colorantes orgánicos convencionales, y aumentó la sensibilidad de detección y el tiempo de retención de la sonda en las células tumorales. Mediante este trabajo, se descubrió por primera vez la regulación positiva de la actividad de la ALP en las células cancerosas o tumorales al ser estimuladas con butirato de sodio y cortisol; asimismo, se usó la microscopía bifotónica (o de dos fotones) para lograr un procesamiento de imágenes profundo y tridimensional de alta resolución espacial, asociado a la actividad de la ALP en células HeLa y esferoides tumorales HepG-2. A través del artículo, se demostró la utilidad de la sonda en el procesamiento de imágenes por detección de fluorescencia a partir de tumores submilimétricos, lo cual representa una poderosa herramienta de apoyo para el diagnóstico clínico y la escisión quirúrgica de tumores.[5]
Para el estudio mencionado previamente, se usaron microscopios confocales de uno y dos fotones. Sin embargo, el reciente microscopio multifotónico FVMPE-RS, cuyo diseño está orientado al procesamiento de imágenes de fluorescencia en profundidad in vivo junto con un galvanómetro de escaneo resonante de alta velocidad (patentado) y una trayectoria de detección óptica altamente sensible, puede procesar imágenes 3D de alta resolución en profundidad a partir de marcadores tumorales de una manera más precisa y eficiente (Figura 7).
La combinación del sistema FVMPE-RS con láseres duales (o de línea dual), más la detección altamente sensible de hasta cuatro canales, soporta un procesamiento de imágenes sincronizado y multicolor más flexible, lo que mejora aún más el rendimiento y la eficiencia de la detección. Además, el escáner autónomo de fotoestimulación permite ganar una estimulación espacial precisa mediante el uso de un láser de femtosegundo. Esta estimulación precisa y la rápida adquisición de señales sincronizadas hacen que el sistema sea eficaz en el control de la luz, la fotodinámica y otras aplicaciones especiales de detección de nanosondas.
Sistema multifotónico FVMPE-RS Excitación infrarroja eficiente: Observación profunda: Escaneo de alta velocidad: Procesamiento de imágenes multicolor de múltiples fotones: Estimulación de luz más flexible: |  |
Figura 7. Sistema multifotónico FVMPE-RS con módulos para el procesamiento de imágenes en profundidad. |
Detección dinámica de nanosondas a partir de células vivas con la solución de súper resolución rápida IXplore™ SpinSR
Las reacciones bioquímicas y otros eventos moleculares en las células vivas a menudo tienen características espaciotemporales dinámicas y significativas. La tecnología óptica para el procesamiento de imágenes puede rastrear con precisión el movimiento de las nanosondas y estudiar sus interacciones con las biomoléculas. Ésta permite a los investigadores monitorear de manera efectiva estos biomarcadores para observar cambios dinámicos a fin de examinar con mayor profundidad la relación entre los estados que presentan y las funciones celulares relevantes. Los endosomas, lisosomas y otros orgánulos desempeñan funciones clave en la transducción de señales y el mantenimiento de la homeostasis metabólica. Dado que el pH de estos orgánulos cambiará durante la endocitosis, la detección rápida y sensible de los valores de pH a partir de estos orgánulos se ha convertido en el centro de la investigación relativa al control dinámico del proceso de endocitosis y al estudio de las relaciones entre sus estados y las funciones celulares.
En el año 2016, el profesor Yiguang Wang de la Universidad de Pekín y el equipo de investigación del profesor Jinming Gao del Centro Médico del Sudoeste de la Universidad de Texas publicaron un documento en el que se describió el diseño de una nanosonda de pH ultrasensible (HyUPS) con una resolución a un solo orgánulo. Ellos usaron esta nanosonda para rastrear y detectar cambios de pH en endosomas/lisosomas y otros orgánulos durante la endocitosis. La sonda reunía tres componentes sensibles al pH, correspondientes a los tres componentes de la endocitosis, y tres rangos de pH. Estos se encontraban marcados respectivamente con los fluorocromos rojo, verde y azul. La sonda logró satisfactoriamente monitorizar en tiempo real y en modo dinámico multicolor la tasa de acidificación de los orgánulos que estaban involucrados en la endocitosis a nivel las células vivas. Esto abrió el camino a una nueva herramienta de procesamiento de imágenes para estudios adicionales de enfermedades disfuncionales endosómicas/lisosomales.[6]
El procesamiento de imágenes con la ayuda de nanosondas a partir de un espécimen vivo requiere un equipamiento de alta velocidad; por lo tanto, el enfoque de escaneo confocal convencional por puntos no cumple con los requisitos. El sistema de microscopio confocal de disco giratorio con super resolución IXplore SpinSR, puede lograr un procesamiento de imágenes multicolor rápido (200 fps) con calidad de súper resolución (110 nm) [Figura 8]. Estas capacidades permiten capturar los procesos dinámicos rápidos a partir de estructuras finas, lo que lo convierte en una herramienta poderosa para que los investigadores de las ciencias de la vida puedan mejorar fácilmente su eficiencia en el procesamiento de imágenes. El controlador en tiempo real (RTCe) patentado supervisa el funcionamiento sincronizado de todos los componentes para minimizar el efecto dañino de la luz de excitación en las muestras. Esta ventaja, junto con los objetivos de aceite de silicona diseñados para biopsias profundas, permite obtener imágenes profundas precisas y a largo plazo de células vivas, esferoides y muestras de organoides.
En la Figura 9, vea un ejemplo de las capacidades del procesamiento de imágenes con súper resolución del sistema IXplore SpinSR, que muestra mitocondrias de células epiteliales por tinción de sonda PKMDR. Desarrollada por el profesor Zhixing Chen de la Universidad de Pekín, la PKMDR es una sonda mitocondrial que minimiza la fototoxicidad en el procesamiento de imágenes de fluorescencia y nanoscopía.
Sistema confocal de disco giratorio IXplore SpinSR
|  |
Figura 8. Sistema de microscopio confocal de disco giratorio con super resolución IXplore SpinSR |
Figura 9. Imagen dotada de súper resolución que muestra mitocondrias de células epiteliales por tinción PKMDR mediante el sistema IXplore SpinSR, el objetivo UPLAPO60XOHR y el procesamiento TruSight™. Imagen por cortesía: Dra. Huiwen Hao; Dr. Junsheng Yang, Prof. Yujie Sun, y Prof. Zhixing Chen. Standard Imaging Co., Ltd. y Sun Lab, Facultad de Tecnologías del Futuro, Universidad de Pekín. NanJing GenVivo Biotech Co., Ltd.
En el último decenio, con el rápido desarrollo de la nanotecnología y las tecnologías ópticas de procesamiento de imágenes, se han logrado muchos avances importantes en las aplicaciones de imágenes bioquímicas con ayuda de las nanosondas fluorescentes. Sin embargo, la aplicación de las nanosondas fluorescentes todavía se ve limitada por su biocompatibilidad, la presencia de un comportamiento intermitente de fluorescencia y otras deficiencias. Mediante el continuo desarrollo e integración de nanomateriales y tecnologías destinadas al procesamiento de imágenes biológicas, más la síntesis química, la física teórica y el análisis de imágenes, se espera que la especificidad, precisión, estabilidad y reproducibilidad de la imagen biológica mejoren aún más con ayuda de nanosondas fluorescentes, ampliando así su potencial para desempeñar un papel más importante en una amplia variedad de campos de investigación.
Referencias bibliográficas:
[2]. Chang, H., Xie, J., Zhao, B., Liu, B., Xu, S., Ren, N., Xie, X., Huang, L., y Huang, W. (2014). Rare Earth Ion-Doped Upconversion Nanocrystals: Synthesis and Surface Modification. Nanomaterials (Basel, Switzerland), 5(1), 1–25.
[3]. Chen, Z., Wu, X., Hu, S., Hu, P., y Liu, Y. Multicolor upconversion NaLuF4 fluorescent nanoprobe for plant cell imaging and detection of sodium fluorescein. J. Mater. Chem. C, 2015, 3, 153-161
Contenidos relacionados
Iluminación de campo oscuro aumentado: procesamiento de imágenes sin marcado a nanoescala
¿Cómo mejorar el procesamiento de imágenes profundas en la microscopía multifotón?
