Los microscopios de escaneo láser confocal son herramientas muy populares en la investigación biológica. Suelen ser usados para visualizar varios fluorocromos a la vez con una discriminación cromática correcta, como también la profundidad de un imagen a partir del interior de una muestra biológica gracias a funciones de seccionamiento mejoradas.
Las recientes innovaciones en tecnología láser favorecen este tipo de aplicaciones y permiten realizar experimentos más avanzados. A través de este blog, se explicará cómo los novedosos láseres de excitación del infrarrojo cercano (NIR), implementados en los microscopios confocales FV3000 de Olympus, están mejorando muchas aplicaciones de multiplexación avanzada.*
Obstáculos de la multiplexación con más de cinco canales en la microscopía confocal: ¿Cómo superarlos?
Primero, se proporcionará una breve reseña sobre los experimentos de multiplexación.
Por muchos años, los investigadores han realizado la inmunofluorescencia con DAPI y otros dos colores, normalmente en el espectro del verde y el rojo.
Sin embargo, a medida que los anticuerpos y los sistemas de procesamiento de imágenes avanzaban a la par con más detectores y un mejor filtrado de la longitud de onda emisora, la inmunofluorescencia de cuatro colores cobró mucha popularidad. La combinación más popular de cuatro colores eran DAPI, verde, rojo y rojo lejano.
No obstante, dos factores críticos suponían un obstáculo para la introducción de un quinto canal para la multiplexación.
1. Una falta de diodos láser NIR con buena calidad de haz.
En un principio, no existían diodos láser con buena calidad de haz para los microscopios de escaneo láser confocal. Los diodos láser requieren una potencia adecuada (no tan elevada), fluctuaciones de potencia mínimas y perfiles de haz compatibles para aplicarlos en el procesamiento de imágenes confocales. Hasta hace poco, existían pocas opciones de diodos láser NIR disponibles para los rangos de longitud de onda requeridos.
Pero todo ha cambiado gracias a la última tecnología de diodo láser. El microscopio confocal FV3000 de Olympus ahora ofrece diodos láser de 730 nm y 785 nm para una excelente excitación de los tintes secundarios, como:
- Cyanine7 (Cy7)
- Alexa Fluor 750
- Alexa Fluor 790
- DyLight 800
- IRDye 800
- Indocianina verde (ICG)
Estos tintes, junto con un número creciente de nuevos fluorocromos, están favoreciendo la incorporación de un quinto y un sexto canal simultáneo para que multiplexación sea cada vez más conveniente.
2. Tubos fotomultiplicadores con sensibilidad reducida en longitudes de onda NIR.
Un segundo obstáculo es que muchos tubos fotomultiplicadores (PMT) presentan una sensibilidad reducida al detectar longitudes de onda típicas en función de una excitación de 730 nm y 785 nm.
Esta sensibilidad reducida en los rangos de detección del infrarrojo cercano es especialmente evidente en los populares PMT de GaAsP que ofrecen una mayor sensibilidad en la mitad del espectro visible. En el rango de 750+ nm, los detectores de GaAsP proporcionan muy poca sensibilidad.
Para superar este desafío, Olympus ha integrado los detectores GaAs de rojizos en nuestro microscopio láser confocal FV3000.
Nuestro sistema FV3000 ahora ofrece detectores GaAs en muchas combinaciones distintas con PMT multialcalinos (estándar) y PMT de GaAsP (alta sensibilidad). Estas configuraciones pueden utilizar los detectores GaAs como quinto o sexto canal* para aplicaciones de multiplexación. *Pueden aplicarse algunas limitaciones.
Combinado con nuestros objetivos de alto rendimiento X Line, el sistema FV3000 pueden ofrecer una corrección de aberración cromática amplia y de alta calidad que va de 400 a 1000 nm. Esto mejora la reproducibilidad del color durante el procesamiento de imágenes por fluorescencia multicolor y de campo claro.
*Es una solución personalizada y es posible que no esté disponible en algunas regiones. Póngase en contacto con su representante local de Olympus para obtener información detallada.
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Video: Presentación del microscopio confocal FV3000
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