Laser Systems for Confocal Microscopy

Los láseres empleados comúnmente en la microscopía confocal de barrido láser son fuentes de luz monocromáticas de alta intensidad, que resultan útiles para una gran variedad de técnicas como la captura óptica, los estudios de procesamiento de imágenes de ciclo de vida, la recuperación de fotoblanqueo y la fluorescencia de reflejo interno total (TIRF). Además, los láseres también son la fuente de luz más usada para la microscopía de fluorescencia de barrido confocal y se han utilizado, aunque con menos frecuencia, en las investigaciones de fluorescencia de campo amplio convencional.

Los dispositivos láser emiten paquetes intensos de luz monocromática que son coherentes, lo que significa que la luz láser está en la fase en espacio y tiempo, y puede colimarse o estrecharse para formar un haz ajustado con una índice de expansión muy bajo. En comparación con otras fuentes de luz, los rangos de longitud de onda extremadamente puros que emite el láser tienen un ancho de banda y una relación de fase que no puede compararse con las lámparas halógenas de tungsteno, las lámparas de descarga de arco o los motores de luz LED. Como resultado, los haces de luz láser pueden viajar grandes distancias y expandirse para llenar aperturas, o bien enfocarse en un punto muy pequeńo con un alto nivel de brillo. Más allá de las similitudes comunes entre todos los láseres, que incluyen un medio de ganancia (fuente de luz), una fuente de excitación (fuente de energía) y un resonador eléctrico, estas fuentes de luz difieren radicalmente en tamańo, coste, potencia de salida, calidad del haz, consumo de energía y vida útil.

La coherencia de la luz monocromática producida por la mayoría de sistemas láser introduce problemas en la aplicación de estas fuentes de luz para la microscopía clásica de campo amplio. Los patrones de difracción y dispersión de la luz se introducen por la interferencia en cualquier superficie de la trayectoria óptica. Además, los diafragmas de apertura y campo, así como la suciedad, también producen artefactos. Estos efectos no deseados pueden minimizarse o eliminarse por medio de diversas técnicas. Los métodos más comunes incluyen la codificación temporal de la luz láser variando rápidamente la longitud de la trayectoria óptica entre la fuente de luz y el microscopio, o escaneando la muestra punto por punto como es el caso de los sistemas de microscopía confocal. Además, la interferencia y otros artefactos suelen poder eliminarse con esta técnica de barrido de apertura. Si la longitud de la trayectoria o el estado de coherencia del haz láser fluctúa a un intervalo más rápido que el tiempo de integración del detector (en efecto, la velocidad de fotogramas del vídeo), los artefactos de dispersión y moteado desaparecen de la imagen.

Una técnica exitosa empleada por algunos investigadores para mejorar el contraste de las imágenes de interferencia diferencial (DIC) producidas con una fuente de luz láser de iones de argón es colocar una suela de vidrio circular, girando a 2500 revoluciones por minuto, en la trayectoria de la luz. Las variaciones rápidas en la longitud de la trayectoria óptica se introducen por las diferencias en el espesor de la suela a medida que la suela gira delante del haz láser expandido. Actualmente, la variación en la longitud de la trayectoria suele conseguirse empleando un tubo de luz de fibra óptica para dirigir la luz entre la fuente de luz y el microscopio. La vibración de la fibra produce cambios continuos en la longitud de la trayectoria óptica, haciendo que el haz pase a ser incoherente temporalmente a frecuencias inferiores a las del nivel de vibración. Las vibraciones pueden generarse usando un dispositivo piezoeléctrico, un altavoz o el ventilador de refrigeración usado en la cabeza del láser.

En la Figura 1 podemos ver un láser de pulsos Ti:zafiro de bloqueo de modo automático, que actualmente es uno de las fuentes de excitación de láser preferidas en la mayoría de investigaciones de microscopía de fluorescencia multifotón. El láser de Ti:zafiro con bloqueo de modo proporciona un gran intervalo de ajuste para la longitud de onda que va de unos 690 a más de 1050 nanómetros, con anchuras de pulso de 100 femtosegundos de longitud aproximadamente. Además, estos dispositivos láser tienen potencia suficiente (superior a 100 milivatios durante todo el rango de ajuste) para la saturación de excitación de dos fotones en la mayoría de fluoróforos. Para garantizar un control correcto de la humedad y la refrigeración en el vidrio del láser, se bombea gas de nitrógeno en la cabeza sellada del láser, que se mantiene a temperatura constante por medio de un refrigerador externo.

La luz producida por muchos sistemas láser se polariza linealmente, con un vector de polarización orientado verticalmente. Esta propiedad puede explotarse en aplicaciones que requieren una fuente de iluminación polarizada, como el contraste de interferencia diferencial, las mediciones de luz polarizada o las investigaciones cuantitativas de anosotropía de polarización de fluorescencia.

Las características de coherencia y polarización del haz láser se miden por medio de la distribución de la luz en la sección transversal del haz, o perfil, que cambia al aumentar la distancia desde el espejo de salida del láser. El siguiente debate sobre las características del haz láser se incluye a modo de descripción general que puede ser útil al utilizar láseres en el procesamiento de imágenes de microscopios, captura láser y otras aplicaciones.

Cuando un láser opera en el modo más simple, el modo electromagnético transversal, conocido como modo TEM(00), el haz emitido tiene una onda planar en la parte frontal y un perfil de intensidad gaussiano (irradiancia). El diámetro del haz láser suele definirse como el valor al que la intensidad ha caído al e(E-2) (13,5 %) de su valor máximo. El perfil gaussiano del haz láser aumenta debido a la difracción, que impide la propagación de un haz perfectamente colimado e induce una expansión transversal de las ondas de luz. Cerca de la apertura de la salida del láser (conocido como campo cercano), los frentes de fase del haz pueden aparecer desordenadas. Como consecuencia, la forma, el tamańo y el perfil de irradiación transversal del haz cambiará rápidamente con la distancia del láser. A distancias más grandes (campo lejano), los frentes de fase se estabilizan en el perfil gaussiano resultante. En algunas referencias de documentación, el campo cercano y el campo lejano se designan con los términos alternativos zona de Fresnel y zona de Fraunhofer, respectivamente. El campo cercano también aparece algunas veces con el nombre de rango de Rayleigh. El campo lejano empieza a una distancia z definida por

z = A⁰₂/Îť

donde A(0) es el diámetro del haz en la apertura de salida y Îť es la longitud de onda de luz emitida por el láser. Si aplicamos esta ecuación a un láser de argón que emite un haz con un diámetro de focalización de 0,6 milímetros a una longitud de onda de 488 nanómetros, el campo lejano empieza aproximadamente a 74 centímetros de la apertura de salida.

En la Figura 2 podemos ver un diagrama esquemático de la geometría del haz láser y la divergencia en el campo cercano y el campo lejano. Como hemos explicado anteriormente, el haz puede considerarse básicamente un conjunto paralelo de frentes de onda que sufren un poco de expansión en el campo cercano. Más allá del campo cercano, el ángulo de divergencia del haz (θ), que se mide desde el centro del haz hasta el borde (e(E-2)), crece más y pasa a ser un parámetro crítico para determinar el diámetro del haz (D) según la ecuación:

Diámetro del haz (D) = 2L • tan(θ)

donde D es el diámetro del haz láser significativo variable y L representa la longitud de la distancia desde la apertura de salida del láser hasta el punto de medición en el haz. En la práctica, varias características del haz láser, como el perfil de irradiación, son factores críticos en muchas aplicaciones de microscopía y puede ser necesario saber la distancia hasta el campo lejano a la hora de configurar el sistema de procesamiento de imágenes. En la Tabla 1 podemos ver los valores calculados de esta distancia (usando la ecuación anterior) para una serie de láseres usados con frecuencia, las líneas de emisión y los diámetros típicos de concentración del haz.

Distancia hasta el campo lejano

Tabla 1

Con independencia de si el haz se visualiza, el carácter gaussiano es importante en la mayoría de aplicaciones láser porque el haz a menudo tiene que enfocarse, formarse y modificarse de otro modo mediante las lentes y otros componentes ópticos. Un haz gaussiano tiene ciertas características de transformación que pueden definirse y que permiten realizar suposiciones sobre la propagación del haz por el sistema óptico.

El radio angular (o ángulo de divergencia del haz; véase la Figura 2), designado con θ (en radianes), de un haz gaussiano en el campo lejano se aproxima mediante la expresión:

θ = Îť /Ď€a₀

donde a(0) es el radio de concentración del haz en la apertura de salida del láser. El diámetro de concentración del haz depende de la longitud de onda del láser, la longitud de la cavidad y otros parámetros de diseńo de la cavidad. A medida que la distancia (z) desde el láser aumenta, el radio de concentración del haz se calcula mediante la ecuación:

a(z) = θ_z

Normalmente, los haces láser se caracterizan por los parámetros de propagación del haz como el cuadrado de M, o K (que es equivalente al recíproco del cuadrado de M), determinado por una combinación de mediciones de campo cercano y campo lejano de la forma siguiente:

M²= Ď€A₀θ/4Îť

Los valores más pequeńos de M2, que reciben el nombre de constante de propagación o factor de propagación, son indicativos de una calidad superior del haz, especialmente en referencia a valores inferiores de diámetro y divergencia. El factor describe la relación del haz real con el del haz gaussiano ideal.

Los haces gaussianos coherentes tienen propiedades específicas que hacen que difieran de los haces de luz incoherentes en su propagación y la transformación por medio de lentes y espejos. En el caso de un haz de difracción limitada, el perfil de intensidad del haz gaussiano es propiamente gaussiano, siempre que el haz no esté truncado por la apertura de la lente. Cuando el diámetro del haz gaussiano es una mitad del diámetro de apertura de la lente, el perfil de intensidad del haz emergente sigue siendo gaussiano. Cuando el diámetro del haz gaussiano es igual al diámetro de apertura de la lente, el perfil de intensidad del haz de salida es una mezcla de la función gaussiana y de la función del disco de Airy. Finalmente, un diámetro del haz gaussiano considerablemente mayor que el diámetro de apertura de la lente genera un perfil de salida de un disco de Airy. En esta última instancia, puede perderse una gran cantidad de potencia del láser debido al sobrellenado de la apertura de entrada de la lente.

El tema del haz gaussiano se explica en muchos libros de texto y los detalles que no se explican aquí pueden obtenerse de fuentes más exhaustivas. Existen dos tipos de manipulación del haz gaussiano de especial interés para el microscopista que utiliza dispositivos láser, concentración del haz y expansión del haz.

Cuando un haz láser se enfoca en un punto muy pequeńo usando un objetivo de microscopio sin aberración (concentración del haz), el radio del punto enfocado (a una distancia de z) se calcula por las expresiones:

a(z) = Îťf/Ď€a₀

donde f es la longitud focal de la lente. A modo de ejemplo, si se utiliza un objetivo 100X con una apertura numérica de 1,3 (produciendo una longitud focal de aproximadamente 1,6 milímetros) para concentrar el haz de 488 nanómetros de un láser de argón con un radio de 488 manómetros con un radio de 0,3 milímetros, el radio de punto enfocado (determinado con la ecuación anterior) es de 0,8 micrómetros. Si multiplicamos por cinco la concentración del haz usando la expansión del haz (como hemos explicado anteriormente) obtendremos un radio de punto enfocado de 0,16 micrómetros aproximadamente.

Cabe destacar que las densidades de alta potencia se consiguen en el punto focal de un haz láser concentrado. Un haz de 10 milivatios enfocados a un punto con difracción limitada de 0,22 micrómetros de diámetro genera una densidad de potencia de 40 millones de vatios por centímetro cuadrado aproximadamente. Estos niveles de energía tan altos pueden degradar rápidamente o incluso destruir la lente y el revestimiento del filtro, además de introducir dańos fotoquímicos considerables en las muestras biológicas. Sin embargo, para un tamańo de punto tan pequeńo, la difusión de energía térmica solo puede ser efectiva en el agua para que el haz de alta energía y de infrarrojo cercano puede provocar pequeńos dańos en una muestra biológica, a no ser que la absorción de la energía por la muestra sea lo suficientemente alta.

En muchas aplicaciones de láseres en microscopía óptica, el haz láser se expande inicialmente por el uso de un expansor de haz de Kepler o Galilei, que en realidad son telescopios invertidos (las características anatómicas del expansor de haz láser típico se ilustran en la Figura 3). La divergencia de un haz gaussiano coherente puede reducirse y el haz puede colimarse de forma óptima en una distancia mayor, si el haz láser se expande primero. Si observamos las ecuaciones anteriores, el radio angular del haz designado con θ, es inversamente proporcional al radio de concentración del haz, a(0), en la apertura de salida del láser. Por lo tanto, la expansión del radio de concentración del haz reduce la divergencia proporcionalmente.

Resulta práctico para muchas aplicaciones en microscopía conectar la salida del láser directamente a la trayectoria óptica del microscopio usando una fibra óptica flexible (como se ilustra en la Figura 4). Esta técnica es preferible al método alternativo de alineación rígida del láser y el microscopio, ya que requiere la utilización de una mesa óptica enorme y exenta de vibraciones y diversos espejos fijos y otros componentes.

Cuando un haz láser se enfoca por medio de una lente en una fibra óptica, la eficacia de acoplamiento y las características del haz que emerge de la fibra dependen en gran medida de la geometría de la fibra. La mayoría de fibras ópticas usadas para el suministro de luz láser están fabricadas con un núcleo de silicio fundido. Estas fibras están formadas por un núcleo interior fabricado con silicio de alto índice de refracción y están rodeadas por un manguito, conocido como envoltura, construido con material de bajo índice de refracción. El reflejo interno total en la interfaz con el núcleo y la envoltura impide que la luz escape de la fibra en toda su longitud. La envoltura puede estar formada por silicio, vidrio, un fluoropolímero duro o una silicona blanda.

Las fibras ópticas se clasifican como de modo único o multimodo dependiendo del diámetro de sus núcleos internos. Una fibra de modo único permite la propagación solo en el modo de orden más bajo en una longitud de onda específica (Figura 4). La longitud de onda propagada y la preservación de la polarización de la onda pueden determinarse por el diámetro de la fibra. Aunque pueden propagarse otras longitudes de onda, lo hacen con una eficacia reducida. El diámetro típico de las fibras de modo único suelen ir de 3 a 6 micrómetros y el perfil de irradiación de salida de una fibra de modo único es gaussiano.

Una fibra óptica multimodo permite la propagación de más de un modo y no está limitada por una sola longitud de onda. Los núcleos internos de las fibras ópticas multimodo son más grandes que las fibras de modo único y van de unos 100 micrómetros a 1,2 milímetros de diámetro de diámetro. El perfil de irradiación de salida de una fibra multimodo tiene una forma plana, conocida como perfil omega, con una apertura numérica que viene determinada por el núcleo y los índices de refracción de la envoltura.

El ángulo del cono de aceptación, θ, del núcleo de la fibra está relacionado con la apertura numérica, NA, de la fibra de la forma siguiente:

NA = sin θ/(n²núcleo - n²envoltura)^1/2

donde representa el índice de refracción. El acoplamiento efectivo de la luz láser en el núcleo de la fibra se produce cuando la apertura numérica del núcleo de la fibra y la del lente de concentración del haz coinciden. La eficacia de la transmisión de luz a través de una fibra óptica suele ser tan alta como el 90% aproximadamente, pero puede reducirse considerablemente (a solo el 60 o 70%) realizando curvaturas con un radio muy pequeńo (menos de 3 centímetros).

A la hora de utilizar cualquier láser, es fundamental impedir que la luz láser reflejada directa o especularmente penetre en los ojos del observador y evitar que el reflejo del haz de un componente del sistema óptico rebote al sistema láser. La primera medida es naturalmente una precaución de seguridad personal, mientras que la última es importante para impedir que un reflector adicional rebote un haz coherente al láser, provocando posibles dańos en el sistema.

La estabilidad de la fuente de luz láser es un aspecto importante en muchas aplicaciones, especialmente en la microscopía cuantitativa, donde las fluctuaciones en la intensidad de iluminación pueden afectar negativamente a los resultados experimentales. Una serie de factores relacionados con las fluctuaciones en la longitud de la cavidad y la emisión estimulada pueden inducir ruido de frecuencia en el haz de salida, pero otras perturbaciones que provocan fluctuaciones de amplitud pueden crear ruido de intensidad de alta frecuencia y variaciones lentas (deriva) en la potencia de salida óptica. Algunas fuentes de estas fluctuaciones de intensidad están relacionadas con la función de la cabeza del láser o la fuente de alimentación. Las fuentes más comunes de ruidos en el haz de salida para las diversas categorías del láser se especifican más abajo:

• Láseres de gas: las faltas de alineación leves procedentes de las vibraciones del resonador, el ruido de las fuentes de la bomba óptica, las oscilaciones del plasma y las inestabilidades del proceso de descarga de iones, las fluctuaciones en la corriente de fuente de energía, los microfónicos derivados de las turbulencias de agua de refrigeración y el ruido inducido por el ventilador en los sistemas de refrigeración de aire forzado todas son fuentes de ruido potenciales.
• Láseres de estado sólido: las fuentes de ruido incluyen microfónicos, fluctuaciones de la fuente de la bomba para las bombas de diodos y la lámpara, los errores de alineación de la cavidad y el ruido aleatorio relacionado con la frecuencia (conocido como ruido 1/f) que está relacionado con las fluctuaciones térmicas en el medio láser.
• Láseres secos: tanto el ruido (alta frecuencia) como la deriva provienen de una falta de homogeneidad en la densidad y de las burbujas de aire en la solución del colorante, además de las inestabilidades en la fuente de la bomba láser y la bomba de colorante.
• Láseres semiconductores (diodo): el ruido puede deberse a las fluctuaciones en la temperatura o la corriente de accionamiento (polarización), y el ruido 1/f está provocado por la captura de portadores en la unión y por otros tipos de efectos de recombinación (orificio de electrón) de los portadores.

Todos los láseres son susceptibles al ruido introducido por sus fuentes de energía. Las fuentes de energía de conmutación, que han pasado a ser comunes por su eficacia y su tamańo pequeńo, tienen una alta probabilidad de introducir ondas en el sistema láser a frecuencias que van hasta decenas de kiloherzios. Estas interferencias, cuando afectan al haz de luz en los sistemas de microscopía óptica, pueden resultar muy difíciles de diagnosticar y suprimir. La complejidad principal es la similitud con el ruido introducido en el sistema por otras fuentes, como los campos electromagnéticos en el entorno del laboratorio. Para conseguir una estabilidad de salida adecuada, los láseres semiconductores deben operarse con suministros de corriente de diodos que tengan la más alta estabilidad eléctrica y el más bajo ruido posible, además de un control preciso de la temperatura. También deben controlarse otras fuentes de ruido externas, como el polvo presente en el laboratorio y las vibraciones derivadas del tráfico local y los equipos de construcción.

La intensidad del haz de los láseres de onda continua (cw) puede estabilizarse controlando electrónicamente la corriente del tubo o usando componentes externos que modulan la intensidad de la luz. Muchas veces se utilizan dos métodos distintos para controlar la corriente de accionamiento del tubo. En el modo de corriente constante, la corriente del tubo se controla directamente por medio de un bucle de retroalimentación electrónico para minimizar las fluctuaciones. Dado que la salida láser también depende de la temperatura, este tipo de circuito de control es más efectivo si se proporciona un control de temperatura adecuado. Los sistemas de estabilización de potencia de salida constante operan controlando la corriente de accionamiento en respuesta a la seńal derivada de un circuito que toma una muestra del haz de salida usando un divisor de haces y un monitor de fotodiodos. Esta disposición física es aplicable a los láseres de gas y a muchas otras geometrías, pero los láseres de diodo más pequeńos suelen disponerse en un paquete que ya incluye un fotodiodo integral. El fotodiodo del monitor toma una muestra de la emisión de la sección trasera de la oblea láser y genera una seńal que permite controlar la retroalimentación de la potencia de salida.

Los componentes externos usados para estabilizar la intensidad del láser suelen emplear un sistema de retroalimentación rápida para controlar un modular electro-óptico que minimiza las fluctuaciones en la potencia del haz. El modulador de celda externo Pockels (véase la Figura 5) está disponible de diversos fabricantes y puede usarse, en principio, para estabilizar la potencia de salida de cualquier láser de onda continua. Las grandes fluctuaciones de intensidad (hasta aproximadamente el 50%) pueden corregirse usando esta técnica pero con una reducción proporcional en la potencia de salida total. Contar con un amplio intervalo de corrección es importante en muchos sistemas. El láser de helio-cadmio, por ejemplo, puede mostrar una variación en la potencia de salida de cerca del 20%, debido en parte a la fuerte oscilación del plasma entre algunas frecuencias del haz. Existen sistemas adecuados para regular cw y bloquear el modo de los láseres dentro de unos pocos cientos de un porcentaje de su potencia de salida, y sobre un rango de frecuencia que va de la corriente directa a varios cientos de megaherzios, con una atenuación de ruido de 500:1 o más.

Los componentes básicos de un modulador de celda Pockels se ilustran en la Figura 5. Los dispositivos externos para regular la intensidad de salida del láser, similares al diseńo ilustrado en la Figura 5, algunas veces están categorizados o comercializados bajo el término de base insonorizante. El concepto fundamental que sustenta los moduladores electro-ópticos usando el efecto de Pockels se basa en un mecanismo para variar las propiedades de polarización de la celda a una velocidad extremadamente rápida para proporcionar un atenuador de haz variable para controlar la intensidad del láser. El estado de polarización de la salida láser determina la atenuación total del modular, pero es posible una transmisión de hasta el 80%. Tras la emisión de la cabeza del láser, una sección del haz se desvía mediante un divisor de haces hasta un fotodiodo, que compara la intensidad con una intensidad de referencia predefinida (seleccionable), y amplifica la seńal de diferencia para poder accionar el modulador electro-óptico de celda de Pockels. La seńal amplificada produce un cambio del índice de refracción en la celda que gira el plano de polarización, variando la atenuación del haz en proporción a la diferencia de tensión que se aplica. Entre las sustancias que muestran un cambio en las propiedades de polarización que cambia en el campo eléctrico (efecto de Pockels) podemos citar el dihidrógenofosfato de potasio y el niobato de litio, y los cristales de estos materiales suelen utilizarse en los moduladores de haz.

En situaciones en las que la luz polarizada aleatoriamente se estabiliza usando un sistema de celda de Pockels, el modulador debe colocarse entre los polarizadores cruzados, y es necesario abordar otras consideraciones adicionales para minimizar los efectos de estos componentes adicionales en la estabilidad del haz. Dado que el polvo, las vibraciones y otras interferencias pueden afectar a la estabilidad del haz en cualquier punto de la trayectoria óptica, es importante que los estabilizadores externos se coloquen lo más cerca posible de la posición de la muestra en los sistemas de microscopía óptica. Esta medida ayudará a garantizar que se suministre el haz más adecuado a la muestra.

Los láseres de diodo, unos dispositivos semiconductores que han estado en desarrollado durante décadas, ahora están disponibles con una potencia de salida suficiente para resultar objetos de interés para los microscopistas. Los láseres de diodo están disponibles en una serie de longitudes de onda que van de la luz ultravioleta a la infrarroja cercana, con una potencia de salida que es suficiente para las aplicaciones de microscopía confocal. Además, estos láseres de diodo incorporan mejoras en la estabilidad y la forma del haz, que les han permitido sustituir a los láseres de gas en prácticamente todas las aplicaciones. Los láseres de diodo suelen tener un ciclo de vida útil que va de 10.000 a 50.000 horas, pero son extremadamente sensibles a las descargas electrostáticas, por lo que deben manipularse con sumo cuidado.

De gran interés para los microscopistas ópticos es el desarrollo de láseres de diodo sintonizables, que pueden competir a nivel de potencia y versatilidad con los láseres de colorante seco y los láseres de Ti:zafiro (de los que hablaremos más adelante y puede verse una ilustración en la Figura 1). Los láseres de colorante sintonizables tienen un intervalo de longitud de onda que va de 600 a 1800 nanómetros y pueden suministrar de 5 a 25 milivatios de potencia. Sus ventajas serían el coste relativamente bajo, el tamańo compacto, la larga vida útil y la baja producción de calor, lo que elimina la necesidad de contar con sistemas de refrigeración externos.

Los láseres de estado sólido bombeados por diodos (DPSS) utilizan un láser de diodo en lugar de gases nobles, lámparas de arco o tubos de flash para bombear el material emisor en estado sólido. La salida de potencia, la calidad del haz y la estabilidad mostradas por los láseres bombeados por diodos se asimilan a las del láser de gas (helio-neón), pero su eficacia y su tamańo son más comparables a los de los láseres de diodo. Los costes de mantenimiento y explotación típicos de los láseres bombeados por diodos son inferiores a los de los láseres de gas, y la mayoría de sistemas están refrigerados por convección o aire forzado.

Los láseres de granate de itrio y aluminio dopado con impurezas de neodimio (Nd:YAG) generan una luz de 1064 nanómetros en el rango de potencia de milivatios. La duplicación de la frecuencia permite obtener un dispositivo compacto con una salida de onda continua de 532 nanómetros, y la triplicación de la frecuencia también puede emplearse para generar una salida pulsada a 355 nanómetros. El resonador de plegado ajustado (TFR) se desarrolló para bombear un cristal de fluoruro de itrio y litio dopado con neodimio (Nd:YLF) con alta potencia y eficiencia, usando un conjunto de láseres de diodo para generar varios vatios de potencia a 1047 nanómetros. La duplicación, triplicación y cuadruplicación de la frecuencia en este tipo de láser genera salidas de potencia de hasta cientos de milivatios de luz coherente a 523, 349 y 262 nanómetros (segunda, tercera y cuarta armónica). Otras ventajas de los láseres de diodo como fuentes de bombeo serían una mayor vida útil (normalmente superior a 5000 horas, en comparación con los pocos cientos de horas para las lámparas), una salida enfocada fácilmente y colimada que coincide con el volumen de emisión pequeńo del láser de estado sólido, y una reducción considerable de la carga térmica de la varilla del láser, que suele requerir refrigeración con agua si se utilizan las lámparas de arco halógenas como bombas.

El desarrollo de láseres de estado sólido bombeados por diodos se ha visto acelerado por las aplicaciones comerciales e industriales que necesitan alta potencia (normalmente varios vatios) en los rangos de longitud de onda verde (532 o 523 nanómetros) y ultravioleta (355 o 349 nanómetros, y la cuarta armónica a 266 nanómetros). La salida en la región espectral ultravioleta está regulada, con energías que van de 100 microjulios a 10 milijulios, duraciones de pulso en el rango de nanosegundos y tasas de repetición tan altas como a 10 kHz. Estos tipos de láser son muy útiles en microscopía para activar la liberación de compuestos enjaulados. Si embargo, las tasas de repetición de pulsos siguen siendo demasiado lentas para usarlos como fuente de iluminación para la mayoría de aplicaciones de microscopía confocal.

El desarrollo posterior ha conducido a la combinación de láseres de estado sólido bombeados por diodos con osciladoresparamétricos ópticos (OPO; véase la Figura 8) para producir una salida pulsada sintonizable que varía continuamente de 205 nanómetros a 2000 nanómetros. Aunque los sistemas disponibles inicialmente han sido costosos y complejos en su funcionamiento, se han creado versiones simplificadas más adecuadas para su uso en microscopía.

Los láseres de zafiro dopado con titanio (conocidos popularmente como láseres de Ti:zafiro, véase la Figura 1) ofrece la posibilidad de sintonización para el suministro de luz continua y pulsada, además de la dependencia del estado sólido. Estos tipos de láser pueden suministrar pulsos de luz muy cortos (aproximadamente de 80 a 100 femtosegundos) a altas velocidades de repetición (100 MHz). El intervalo de longitudes de onda sintonizables va de la región roja lejana a la región espectral de infrarrojo cercano (de 700 a 1000 nanómetros). La mayoría de estos láseres operan con bombeo óptico usando láseres de argón de alta potencia y necesitan refrigeración de agua. Debido a su alto coste y la complejidad de su operación y mantenimiento, el uso de los láseres de Ti:zafiro se ha limitado principalmente a la microscopía de multifotón.

Conclusiones

La principal diferencia entre la microscopía de fluorescencia de láser confocal y multifotón es el tipo de láser usado en estos tipos de técnicas complementarias. Los láseres para microscopía multifotón son bastante más caros y difíciles de operar que los láseres compactos de refrigeración de agua empleados en la microscopía confocal.

Las aplicaciones actuales de láseres en microscopía están creciendo rápidamente en áreas de microscopía confocal, captura óptica y liberación de compuestos enjaulados y fluoróforos. El desarrollo de láseres compactos de estado sólido con líneas de emisión en el espectro debería servir para ampliar todavía más la utilización de estos dispositivos en la microscopía.