Información básica sobre los microscopios de escaneo láser
Los microscopios de escaneo láser usan la iluminación láser para generar imágenes 3D de alta resolución y alto contrate provenientes de muestras escaneadas punto por punto. Existen dos tipos comunes de microscopios de escaneo láser que son los confocales y los multifotón (o multifotónicos). Si bien los dos usan láseres para excitar la muestra, existen unas cuantas diferencias clave entre ellos. A continuación, se explicará el funcionamiento, uso y los tipos de imágenes que pueden crear los microscopios de escaneo láser, ya sea de tipo confocal o multifotón.
Microscopios de escaneo láser confocal |
Microscopios de escaneo láser multifotón |
Principios básicos sobre los microscopios de escaneo láser confocal
El funcionamiento de los microscopios de escaneo láser confocal se basa en el uso de una onda continua (CW) de longitud de onda corta que transmite luz de excitación de alta intensidad para iluminar una muestra. Este láser se ve reflejado hacia un espejo dicroico y, después, hacia dos otros espejos que se encargan de escanear el láser a partir de la muestra teñida. La tinción en la muestra, al ser excitada por el láser, da respuesta fluorescente y emite una luz de larga longitud de onda que es fragmentada por los espejos usados previamente para escanear la luz de excitación. La luz emitida pasará a continuación a través del espejo dicroico, en donde se enfocará en un estenopo para ser capturada y medida por el detector. El detector se encuentra conectado a un PC que elabora imágenes 3D digitales punto por punto. Dado que el estenopo bloquea cualquier fluorescencia fuera de enfoque (o desenfocada), la imagen que se crea presenta detalles superiores. El principio de la microscopía de escaneo láser confocal es que tanto el láser como el detector se enfocan en el mismo punto de la muestra; y, este punto deriva al final en la creación de una imagen completa de la muestra. |
Principios básicos sobre los microscopios de escaneo láser multifotón
Los microscopios de escaneo láser multifotón trabajan de forma similar a los microscopios de escaneo láser confocal. Sin embargo, mientras los microscopios de escaneo láser confocal usan un láser visible de longitud de onda corta para excitar la muestra, la microscopía de escaneo láser multifotónica usa un láser de emisión infrarroja (IR) en femtosegundo con longitudes de onda dos veces más largas que las requeridas para una excitación monofotónica. Cuando la tinción en la muestra absorbe dos fotones de forma simultánea, ésta puede emitir fluorescencia. Este fenómeno de absorción de dos fotones sólo ocurre en la posición de enfoque donde la densidad del fotón se concentrará altamente; y, sólo la tinción en dicho punto focal puede excitarse y emitir fluorescencia. Por lo tanto, un sistema microscópico de escaneo láser multifotón no requiere una apertura estenopeica para bloquear la fluorescencia fuera de enfoque dirigida al detector no descaneado (NDD) y encima la fluorescencia a partir del punto focal puede ser detectada eficientemente. La motivación detrás del método de excitación alternativo es que un láser de longitud de onda más larga proporciona una penetración más profunda en el tejido, lo que viabiliza la observación y la generación de imágenes a partir de cientos de micrómetros de profundidad en el volumen de un tejido vivo. Además, la fototoxicidad disminuye en comparación con los láseres visibles de longitud de onda corta. Por consiguiente, los microscopios de escaneo láser multifotón son más adecuados para el estudio in vivo de células y tejidos vivos provenientes de animales vivos.
Usos de los microscopios de escaneo láser
Los microscopios de escaneo láser confocal son un gran beneficio en una diversidad de campos, a pesar de que son usados mayormente en la investigación biológica. Estos son usados frecuentemente en la investigación de la biología celular, la investigación oncológica y la investigación de células madre, ya que cuentan con la capacidad para crear imágenes 3D de células dotadas de detalles superiores, lo que permite a los observadores una visualización interna de la muestra escaneada. Esto se debe a que los microscopios de escaneo láser confocal pueden seccionar ópticamente la luz para producir imágenes de alta resolución a partir de muestras de tejido grueso sin necesidad de seccionarlas físicamente. Por su parte, los microscopios de escaneo láser multifotón que ofrecen una penetración profunda del láser de emisión IR en femtosegundo, funcionan mejor en la obtención in vivo de imágenes provenientes de animales vivos. Por esta razón, a menudo son seleccionados para la investigación en la neurociencia y la investigación oncológica.
Ventajas y desventajas de los microscopios de escaneo láser
Los microscopios de escaneo láser han sido parte integral del estudio de células y tejidos biológicos, en gran parte, gracias a su capacidad para escanear muestras punto por punto. Las ventajas adicionales de un microscopio de escaneo láser confocal engloban la capacidad para crear imágenes 3D de células y tejidos de alta resolución y alto contraste sin tener que seccionar físicamente la muestra.
La razón por la que los microscopios de escaneo láser pueden producir imágenes de tan alta calidad se debe a su eficiencia en el rechazo de la luz fluorescente desenfocada a través del estenopo confocal a fin de que el detector solo capte un punto enfocado a la vez.
Por esta misma razón, es posible que la compilación de una imagen 3D completa a partir de una muestra requiera tiempo. Sin embargo, existen avances en el equipamiento disponible para acelerar el proceso. En comparación con el escaneo galvanométrico tradicional, el escaneo resonante permite obtener imágenes con mayor velocidad de hasta 30 fps a fin de observar eventos rápidos y dinámicos, como el flujo sanguíneo o el flujo de iones dentro de las células.
Comparación de escaneo láser sin y con disco giratorio
Un ejemplo de avance tecnológico que aceleró la capacidad de adquisición punto por punto en los microscopios de escaneo láser fue la introducción del disco giratorio. La microscopía confocal de disco giratorio se concentra en la cantidad de estenopos usados para bloquear la luz fluorescente desenfocada. Mientras que la microscopía de escaneo láser confocal emplea un solo estenopo, la microscopía confocal de disco giratorio emplea un disco opaco con cientos de estenopos que gira a altas velocidades. Esto favorece el procesamiento de imagen de una muestra completa a la vez en lugar de punto por punto. Esto también permite reducir el fotodaño y el fotoblanqueo.
Imágenes adquiridas con el microscopio de escaneo láser
Como se mencionó, la alta resolución y el alto contraste en las imágenes que proporciona el microscopio de escaneo láser confocal se deben al rechazo de la luz fluorescente fuera de enfoque que atraviesa el estenopo antes de llegar al detector. Después de que la imagen 3D se crea, los observadores pueden manipularla y en ciertos casos explorar su interior.
Microscopía de escaneo láser vs. microscopía electrónica de escaneo
Si bien poseen un nombre similar, la principal diferencia entre el microscopio de escaneo láser y el microscopio electrónico de escaneo es el método de iluminación que se aplica en la muestra. Mientras que la microscopía de escaneo láser emplea un láser o láseres de excitación, la microscopía electrónica de escaneo, como su nombre lo evidencia, irradia la muestra con un haz de electrones. Los electrones reflejados o los electrones secundarios a partir de la superficie de la muestra producen señales referentes a la topografía o composición, que son captadas por el detector. Dado que la muestra debe estar aislada, la microscopía electrónica de escaneo no puede aplicarse a la observación de muestras vivas.
Magnificación del microscopio de escaneo láser
Los microscopios de escaneo láser pueden usarse con una variedad de objetivos de magnificación. Por lo tanto, la magnificación máxima del microscopio de escaneo láser depende del objetivo que se use. Los objetivos de baja magnificación son ideales para capturar la estructura de una muestra de tejido completa. Si se requiere capturar la morfología de las células que componen el tejido, un objetivo de magnificación media podría ser suficiente. Por otro lado, los objetivos de gran magnificación pueden ser usados para visualizar la microestructura dentro de las células que forman el tejido.
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