Introducción al método de contraste de gradiente

1. Introducción

Desde su invención en el siglo XVII, los microscopios ópticos o de luz han contribuido de gran manera en la investigación biológica, como en el descubrimiento de microorganismos y de eritrocitos (glóbulos rojos). Después, con el desarrollo de la tecnología de tinción/coloración para muestras en el siglo XIX, las estructuras transparentes pudieron ser teñidas con agentes de contraste de color a fin de observarlas de forma más fácil. Sin embargo, la tinción/coloración es tóxica; por ende, su uso es limitado en muestras vivas. A partir del siglo XX, se desarrollaron varios métodos de observación para objetos transparentes sin tinción (como la microscopía de contraste de fases), los cuales han sido fundamentales como herramientas para la investigación biológica hasta el día de hoy.

2. Variación en los métodos de contraste de fases

Los métodos de observación de fases comunes, dedicados a observar objetos transparentes sin usar la tinción, se explican brevemente en la Figura 1 según la composición de los elementos ópticos. Los métodos de observación de fases convencionales se forman por elementos ópticos específicos ubicados respectivamente en la pupila del condensador y la pupila del objetivo.

El método de contraste de fases (Figura 1a) emplea la siguiente combinación: una lente de condensador específica dotada de una apertura anular y una lente de objetivo específica dotada de un anillo en la placa de fase. A partir de los rayos que atraviesan la apertura anular del condensador, aquellos que pasan directo a través de la muestra también pasan a través de la placa de fase de la pupila del objetivo. A su vez, los rayos que son desviados a partir de la muestra pasan fuera de la placa de fase, lo que produce contraste de luz y sombra en el punto donde los dos componentes se interponen entre sí. Un rasgo característico de este proceso son las manchas de luz, llamadas halos, que aparecen en etapas en las que la distribución del índice de refracción cambia en la muestra. Por ende, este método no es adecuado para muestras gruesas, ya que el halo deviene muy intenso.

El método de contraste de interferencia diferencial (Figura 1b) se forma por un interferómetro de cizalladura de polarización con los prismas complementarios de Wollaston en las posiciones de la pupila del condensador y la pupila del objetivo. La imagen de la muestra deviene una doble imagen, ligeramente desviada hacia una dirección fija; y, se aplica un sombreado en el paso del índice de refracción para proporcionar la apariencia tridimensional. Dado que se usa la interferencia de polarización, la observación será imposible si hay presencia de una placa de Petri de plástico u otro objeto que podría causar la distorsión polarizada en la trayectoria óptica.

El método de contraste de modulación (Figura 1c) limita la orientación del haz de iluminación a una sola dirección por medio de la apertura en forma de muesca de la pupila del condensador. La orientación del haz de luz hace que la porción directa de la luz en la muestra aparezca gris; sin embargo, el contraste de la parte refractada cambiará en función de la orientación de la refracción gracias al modulador de la pupila del objetivo. Si se transmite o se tapa una porción de luz, puede obtenerse una imagen tridimensional similar a la del método de contraste de interferencia diferencial. Puesto que la polarización no es usada en el método de contraste de modulación, es posible usar recipientes de plástico, como las placas de Petri. Sin embargo, la resolución se ve ligeramente reducida con este método, ya que limitar la dirección del haz de iluminación hace referencia a una apertura numérica (A. N.) de iluminación pequeña.

Figura 1. Configuración óptica de varios métodos de observación de fases

Elementos ópticos requeridos en los diferentes métodos de observación de fases. a. Método de contraste de fases b. Método de contraste de interferencia diferencial c. Método de contraste de modulación d. Método de contraste de gradiente

3. Método de contraste de gradiente

El método de contraste de gradiente (Figura 1d) se caracteriza por generar una imagen pseudotridimensional similar a la del método de contraste de interferencia diferencial. A diferencia de otros métodos de observación de fases que requieren múltiples componentes ópticos para generar el contraste sin tinción en muestras, el contraste de gradiente puede ejecutarse con tan sólo introducir un filtro de densidad neutra (ND) de gradiente en la pupila del objetivo.

Conceptos básicos del método de contraste de gradiente

El filtro de densidad neutra (ND) de gradiente, que es introducido en la posición de la pupila del objetivo, posee una transmitancia de disminución monotónica hacia una sola dirección. El diámetro de la apertura de la lente del condensador, proyectada a la posición de la pupila del objetivo, experimenta en cierta medida una reducción en comparación con el diámetro de la pupila del objetivo. Allí donde la distribución del índice de refracción de la muestra es plana, la imagen de la apertura de la lente del condensador se proyecta a la posición central de la pupila del objetivo y es afectada de forma subsecuente por la transmitancia cercana al centro del filtro de densidad neutra (ND) de gradiente (Figura 2a). Cuando se genera una inclinación en la distribución del índice de refracción de la muestra, la imagen de la apertura de la lente del condensador es trasladada a partir del centro del filtro ND del gradiente; por lo tanto, cuando el haz de luz refracta en la ubicación de la muestra hace cambiar la transmitancia completa que pasa por el filtro de ND de gradiente (Figura 2b y c). Por consiguiente, se crea la imagen con una iluminación correspondiente a la inclinación del índice de refracción de la muestra; y la distribución del índice de refracción de la muestra aparece de forma tridimensional (Figura 2d).

La apertura de la lente del condensador puede ser ajustada mediate un tope de apertura. Si ésta es relativamente amplia, el cambio en la iluminación debido a la inclinación del índice de refracción en la muestra puede que no sea suficiente. Así pues, la imagen capturada con el sensor de imágenes se muestra enfatizada y evidenciada con un contraste fácil de ver.

Figura 2. Ilustración de los conceptos básicos del método de contraste de gradiente

Descripción de los conceptos básicos del contraste entre la luz y la sombra en un objeto de fase por medio del método de contraste de gradiente. a. Allí donde la distribución de fases a partir de la muestra es plana, el haz de luz atraviesa y pasa de forma directa cerca del centro del filtro ND inclinado. b, c. Si la distribución de fases a partir de la muestra está inclinada, los rayos de luz refractan para que la dirección de la inclinación atraviese la parte más clara del filtro ND inclinado (b) o (c) atraviese la parte más oscura. d. La imagen bajo observación se visualizará con un contraste de luz y sombra en función de la dirección de inclinación que presente la distribución de fases de la muestra.

Características del método de contraste de gradiente

La imagen de fase generada por el método de contraste de gradiente tiene muchas ventajas frente a los métodos de observación de fases convencionales. El método de contraste de gradiente puede aplicarse a muestras gruesas, ya que no se producen halos a diferencia del método de contraste de fases. Asimismo, como no se basa en la polarización, a diferencia del método de contraste de interferencia diferencial, el método de contraste de gradiente puede generar imágenes prácticas pseudotridimensionales a partir de muestras, como recipientes de plástico. Además, como su apertura numérica (A. N.) de iluminación es superior a la de otros métodos, es menos probable que sufra problemas causados por el procesamiento de imágenes que implica la tapa de una placa Petri con gotas de agua. Esta función también evita la degradación de la resolución que se genera por el uso de un elemento de bloqueo en el método de contraste de modulación. Otra práctica ventaja es que no hay necesidad de atribuir un objetivo específico o de cambiar elementos en el cambio de objetivos, lo que lo hace rápido y fácil.

Configuración óptica del método de contraste de gradiente

La configuración óptica del sistema de procesamiento de imágenes APX100 se muestra en la Figura 3. La luz es irradiada hacia la muestra a través de la trayectoria óptica y su imagen se genera en la superficie del procesamiento de imágenes.

Hay un filtro ND de gradiente ubicado en la posición que se conjuga con la posición de la pupila del objetivo. Este filtro interviene en la trayectoria óptica sólo cuando el sistema está configurado para el método de contraste de gradiente. El diámetro de apertura del condensador se ajusta de forma automática al valor apropiado en función de la magnificación y diámetro de la pupila del objetivo.

Figura 3. Configuración óptica del sistema APX100 para la observación de contraste de gradiente en muestras sin tinción

Aplicaciones

A continuación, se pueden observar células HeLa a partir de los contenedores 1 y 2 mediante un objetivo 10x. Las imágenes fueron capturadas por medio de los cuatro métodos de observación tratados en la presente para fines comparativos.

1. Placa inferior de vidrio ※Cubierta de plástico instalada
2. Microplaca de 12 pocillos ※Gotas de agua adheridas en parte superior de cubierta de plástico

Comparación de resultados:

1. La imagen del contraste de gradiente puede compararse con las imágenes del contraste de fase y del contraste de modulación. En la imagen del contraste de interferencia diferencial, la polarización aplicada se reduce debido a la cubierta de plástico; por lo tanto, el contraste es bajo.
2. A diferencia de los otros métodos de observación, la imagen del contraste de gradiente presenta un campo visual más uniforme dotado de un buen contraste. La apertura numérica (A. N.) de la iluminación es más amplia que en otros métodos de observación y es menos afectada por factores externos en la muestra o por las gotas de agua en el recipiente.

4. Resumen

El contraste de gradiente es un método de observación de objetos en fase que usa una configuración óptica simple y requiere solamente la presencia de un filtro ND de gradiente en la pupila del objetivo. Este método funciona bien al observar muestras vivas y transparentes sin tinción. Las ventajas del método de contraste de gradiente, frente al método de observación de objetos en fase convencional, son las siguientes:

• Buen funcionamiento con muestras gruesas.
• Eficaz en muestras ubicadas en una placa de plástico Petri.
• Observaciones que pueden llevarse a cabo a través de la cubierta de una placa de Petri, lo que reduce riesgos de contaminación en los cultivos celulares.
• No se requiere objetivo específico.
• No se requiere cambio de objetivos con el intercambio de elementos.

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