Life Science Solutions
Note d’application

Imagerie à haute résolution des interactions de cellules osseuses à l’aide du microscope confocal FLUOVIEW FV3000 et d’un objectif à immersion dans l’huile X Line à grossissement 40x


Les cellules osseuses se régénèrent constamment en maintenant un équilibre entre la résorption osseuse ostéoclastique et la néoformation ostéoblastique. Certains facteurs influant sur la santé peuvent cependant provoquer un déséquilibre pouvant conduire à des maladies osseuses entraînant la friabilité des os, comme l’ostéoporose. Pour bien comprendre le mécanisme du remodelage osseux, il est important d’examiner les interactions entre les ostéoclastes et les ostéoblastes.

Dans le cadre de cette étude, nous avons préparé une coupe transversale d’un tibia de souris (figure 1), et nous y avons examiné de près les ostéoclastes et les ostéoblastes au niveau de la limite séparant la moelle osseuse de l’os cortical. Pour ce type d’observation microscopique, il faut habituellement utiliser dans un premier temps un objectif à faible grossissement pour l’obtention d’un champ de vision large permettant de cibler une région d’intérêt, puis un objectif à immersion dans l’huile à fort grossissement pour l’observation à résolution plus élevée des détails. Cette approche peut cependant être difficile à mettre en œuvre, car il y a un risque de perdre la région d’intérêt au moment de la permutation des objectifs.

Dans notre cas, nous avons pu passer du champ de vision large requis pour repérer la région d’intérêt à l’observation des structures fines en haute résolution au moyen d’un seul objectif à immersion dans l’huile 40x, ce qui a évité la permutation d’objectif.

Figure 1 : Coupe transversale d’un tibia de souris
Figure 1 : Coupe transversale d’un tibia de souris

Imagerie haute résolution des interactions entre cellules osseuses à l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile X Line 40x (UPLXAPO40XO)

Nous avons examiné la zone séparant la moelle osseuse de l’os cortical sur une coupe transversale d’un tibia de souris, ainsi que le point de contact (signalé par * dans la figure 2a) des ostéoblastes (en vert) avec les cellules endothéliales vasculaires (en jaune) et le site d’interaction (signalé par # sur la figure 2a) entre les ostéoblastes et les ostéoclastes (en rouge). Le champ de vision large de l’objectif à immersion dans l’huile 40x nous a permis de repérer l’emplacement exact de l’image à fort grossissement (encadré dans la figure 2a) dans la vue générale.

À l’aide du zoom électronique, nous avons pu observer de près le site d’interaction des ostéoblastes avec les ostéoclastes (figure 2b). La qualité d’image obtenue avec l’objectif X Line UPLXAPO40XO était presque la même que celle obtenue avec un objectif classique UPLSAPO60XO (figure 2c).

Figure 2 : Images en fluorescence d’une coupe transversale d’un tibia de souris.

Figure 2 : Images en fluorescence d’une coupe transversale d’un tibia de souris.
Image obtenue à l’aide d’un facteur de zoom électronique 1x et d’un objectif UPLXAPO40XO
Image obtenue à l’aide d’un facteur de zoom électronique 3,45x et d’un objectif UPLXAPO40XO
Image obtenue à l’aide d’un facteur de zoom électronique 2,03x et d’un objectif UPLXAPO60XO

Conditions d’imagerie
Microscope : Système FV3000
Objectif : UPLXAPO40XO (UPLSAPO60XO utilisé comme référence)
Lasers : 488 nm (Alexa Fluor 488, vert), 561 nm (Alexa Fluor 568, rouge), 640 nm (Alexa Fluor 647, jaune)


L’apport du microscope confocal FV3000 pour notre expérience

Imagerie microscopique haute performance avec les objectifs X Line

La grande ouverture numérique des objectifs X Line leur permet de capter davantage de lumière pour produire des images à luminosité et à résolution élevées.

Lisez un document technique sur les objectifs X Line

Imagerie microscopique haute performance avec les objectifs X Line

Obtenez des images à rapport signal sur bruit élevé sous une lumière d’excitation très faible

Basés sur une technologie de détection spectrale brevetée, les détecteurs TruSpectral du microscope confocal FV3000 associent une sensibilité élevée et une grande souplesse spectrale afin de détecter tous les fluorophores, même les moins lumineux. Les détecteurs TruSpectral intègrent jusqu’à quatre canaux de tubes photomultiplicateurs GaAsP (PMT) pour un rendement quantique pouvant atteindre 45 %, ce qui permet désormais de visualiser des échantillons d’une luminosité trop faible pour être visualisés avec un équipement classique. Le refroidissement par effet Peltier réduit le bruit de fond de 20 % pour les images à signal sur bruit élevé sous une lumière d’excitation très faible. Obtenez des images à rapport signal sur bruit élevé sous une lumière d’excitation très faible

Commentaire de la docteure Yukiko Kuroda

docteure Yukiko Kuroda

Les sites d’interaction étaient difficiles à retrouver durant l’imagerie à haute résolution des interactions entre les ostéoclastes et les ostéoblastes au moment de la permutation entre l’objectif à sec à faible grossissement pour l’obtention d’un champ de vision large et l’objectif UPLSAPO60XO permettant d’obtenir une imagerie haute résolution. Une autre difficulté consistait à ajouter de l’huile pendant le processus d’imagerie. De plus, lorsque nous avons utilisé seulement l’objectif UPLSAPO60XO pour l’ensemble du processus d’imagerie, il nous a fallu beaucoup de temps pour repérer la région d’intérêt à cause de l’étroitesse du champ de vision.

Cette étude démontre qu’il est possible de repérer les sites d’interaction et d’acquérir des images à haute résolution équivalentes à celles capturées avec l’objectif UPLSAPO60XO en utilisant uniquement un objectif à immersion dans l’huile 40x (UPLXAPO40XO) ayant une ouverture numérique élevée (NA) équivalente à UPLSAPO60XO. Nous avons ainsi pu observer efficacement les interactions entre les ostéoclastes et les ostéoblastes en utilisant uniquement l’objectif UPLXAPO40XO.

Remerciements
Cette note d’application a été rédigée avec l’aide de la docteure Yukiko Kuroda. Elle enseigne à l’Université Keio et elle a produit les images de cette étude.

Appareil requis pour cette application

Microscope confocal à balayage laser

FV3000

  • Disponible en configuration galvanomètre seul (FV3000) ou hybride galvanomètre / résonant (FV3000RS)
  • Nouvelle détection TruSpectral haute efficacité et grande précision pour tous les canaux
  • Optimisé pour la prise d’images de cellules vivantes avec une sensibilité élevée et une faible phototoxicité
  • Inverted and upright frame options to suit a variety of applications and sample types
Objectifs apochromatiques étendus

UPLXAPO

  • Grande ouverture numérique, planéité homogène étendue des images et compensation des aberrations chromatiques sur une large gamme allant de 400 nm à 1000 nm.
  • Image de précision très fiable pour un large éventail d’applications allant de la microscopie en fluorescence/en fond clair à la microscopie confocale/en super résolution.

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