Imagerie volumétrique dynamique avec le microscope confocal FV3000RS : reconstitution 3D de la dynamique de l’actine dans une spore de Colletotrichum graminicola

Colletotrichum graminicola est un pathogène fongique très répandu, en particulier dans les cultures céréalières comme le blé et le maïs. Dans le maïs, les infections fongiques par C. graminicola sont responsables de l’anthracnose, une maladie qui se traduit par la brûlure des feuilles et qui cause de graves dégâts dans les cultures et des pertes financières importantes pour les agriculteurs. La compréhension de la dynamique cytosquelettique des spores germées de C. graminicola pourrait donc contribuer à la prévention de la maladie.

Organisation des câbles d’actine filamenteuse avant la germination

Dans cette expérience, le microscope FLUOVIEW FV3000RS a été utilisé pour étudier la dynamique de l’actine d’une spore de C. graminicola avant la germination. Des câbles d’actine filamenteuse peuvent être observés dans une spore en forme de croissant qui n’a pas encore germé. Les câbles se sont organisés de manière à s’étendre dans le sens de la longueur à travers la spore au niveau du plan de contact avec la surface. On peut observer la rétraction des câbles d’actine du centre vers l’une ou l’autre extrémité de la spore.

Figure 1 : Reconstitution XYZT de la dynamique de l’actine dans une spore de C. graminicola avant germination.

Conditions d’imagerie
Objectif à immersion dans l’huile TIRF, NA : 1,49, 100X (UAPON100XOTIRF)
Microscope confocal à balayage laser FLUOVIEW FV3000RS
Lasers : 488 nm (GFP, vert), 561 nm (CID, gris)
Scanner résonnant
Images XY : 0,272 s/image
Série Z : 22 niveaux (6 s/section)
Série T : 30 empilements en Z acquis en 3 minutes

Observation de deux événements cytosquelettiques distincts pendant la germination

Une fois que l’actine s’est organisée en câbles, le processus de germination d’une spore de C. graminicola est marqué par deux événements cytosquelettiques successifs, au cours desquels des patches et des câbles d’actine se forment. Au cours du premier événement, le cytosquelette se réorganise pour former un septum qui délimite la spore fongique en deux cellules distinctes (représentées par la barrière médiale sur toute la largeur de la spore). Après la septation, des câbles d’actine se forment sur le site de germination et s’étendent dans le tube germinal en développement vers l’apex. Ces deux événements sont visibles sur les figures 2 et 3.

Figure 2 : Reconstitution XYZT de la formation de la cloison transversale lors de la septation dans une spore en germination de C. graminicola, suivie de la formation d’un tube germinal.

Conditions d’imagerie
Objectif à immersion dans l’huile TIRF, NA : 1,49, 100X (UAPON100XOTIRF)
Microscope confocal à balayage laser FLUOVIEW FV3000RS
Lasers : 488 nm (GFP, vert), 561 nm (CID, gris)
Scanner résonnant
Images XY : 0,470 s/image
Série Z : 31 niveaux (5,35 s/empilement) 
Série T : 34 empilements en Z acquis par intervalles d’une minute durant 33 minutes

Figure 3 : Reconstitution 3D du cytosquelette d’actine dans une spore en germination de C. graminicola, dans laquelle le tube germinal en développement est clairement visible.

Conditions d’imagerie
Objectif à immersion dans l’huile TIRF, NA : 1,49, 100X (UAPON3XOTIRF)
Microscope confocal à balayage laser FLUOVIEW FV3000RS
Lasers : 488 nm (GFP, vert), 561 nm (CID, gris)
Scanner galvanométrique
Sections Z : 17 niveaux

Apport du microscope confocal FV3000 à notre expérience

Maintien de la mise au point pendant les prises de vue par intervalles en 4D à l’aide du système de compensation de la dérive en Z TruFocus d’Olympus

Le système avancé de compensation de la dérive en Z TruFocus facilite l’acquisition de plusieurs empilements en Z séquentiels sans dérive dans la dimension Z. Cela permet de réaliser en continu des prises de vues 3D par intervalles claires et parfaitement nettes et d’étudier la dynamique des protéines dans l’ensemble de l’échantillon sans se soucier de la dérive en Z.

Acquisition rapide en 4D à l’aide du scanner résonnant

Le microscope FV3000RS est doté d’un scanner résonnant haute performance qui permet une acquisition rapide de la dynamique des cellules vivantes par intervalles. Le scanner résonnant du microscope FV3000RS maintient également un champ de vision 1X complet avec un indice de champ de 18, des vitesses d’imagerie de 30 images par seconde à 512 × 512 pixels. Grâce au scanner résonnant, les chercheurs peuvent acquérir en quelques secondes des empilements en Z de nombreux plans en haute résolution de phénomènes rapides dans des cellules vivantes.

Les détecteurs GaAsP TruSpectral offrent une sensibilité élevée pour l’imagerie de cellules vivantes

Intégrée dans tous les microscopes confocaux FV3000, la technologie de détection TruSpectral assure un rendement lumineux supérieur à celui des unités de détection spectrale classiques. Le rendement de transmission des réseaux de diffraction holographique en phase volumique est jusqu’à trois fois plus élevé que celui des réseaux par réflexion. Combiné à des photomultiplicateurs GaAsP haute haute efficacité, le détecteur spectral haute sensibilité du microscope FV3000 ne nécessite qu’une puissance laser minimale pour produire des images avec un rapport signal/bruit élevé, ce qui permet de réaliser une imagerie des cellules vivantes puissante sans être nocive.

Commentaire de Joseph Vasselli et du Dr. Brian Shaw

Notre recherche a pour objectif de comprendre le rôle du cytosquelette et des protéines endocytaires dans la croissance et le développement des champignons filamenteux. Le suivi de la localisation spatio-temporelle de ces protéines lors des changements de polarité de croissance est crucial pour nos expériences. La compensation de la dérive en Z exceptionnelle du microscope FV3000, les détecteurs haute sensibilité et le scanner à résonance rapide nous permettent d’acquérir des reconstitutions XYZT haute résolution pour étudier efficacement la dynamique de ces protéines dans les cellules vivantes.

Remerciements

Cette note d’application a été rédigée avec l’aide des chercheurs suivants :