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Note d’application

Développement d’une nouvelle application FUCCI (CA) : une sonde fluorescente pour la visualisation des cycles cellulaires


Le FUCCI (indicateur de cycle cellulaire par fluorescence dépendant de l’ubiquitination) est un jeu génétiquement codé de deux capteurs fluorescents pour le suivi du cycle des cellules vivantes. Le FUCCI (CA), récemment élaboré en 2017, marque les noyaux avec mCherry (rouge) ou mVenus (bleu) en fonction de la phase du cycle cellulaire.  Le FUCCI (CA) produit une expression abondante de mCherry tout au long de la phase G1, avec une diminution abrupte de la fluorescence rouge à la fin de la phase G1. Le FUCCI (CA) peut être utilisé pour détecter une phase G1 courte de manière fiable et pour distinguer les phases S et G2, ce qui était difficile à faire auparavant.

FUCCI (SA) 

Fucci (SA)

FUCCI (SA) 

Fucci (CA)

Figure 1 : Visualisation de la progression du cycle cellulaire par le FUCCI (SA) et le FUCCI (CA)

LAcquisition d’images par intervalles de temps réguliers à faible phototoxicité de CSE non différenciées

Les cellules souches embryonnaires (CSE) non différenciées prolifèrent rapidement et sont très délicates. La phototoxicité pendant l’imagerie par intervalles de temps réguliers peut endommager les CSE et réduire leur vitesse de prolifération. Il devient alors difficile de procéder à une imagerie par intervalles de temps réguliers des CSE dans des conditions précises d’un point de vue physiologique. Le microscope FV3000 permet de réaliser une imagerie par intervalles de temps réguliers à faible phototoxicité en utilisant une puissance laser extrêmement faible, grâce à un trajet lumineux très efficace et à des dispositifs de détection sensibles. Ces propriétés du FV3000 ont permis à un groupe de recherche de réaliser une expérience d’imagerie par intervalles de temps réguliers se déroulant sur 57 heures, au cours de laquelle trois cycles cellulaires normaux de CSE non différenciées en division rapide ont été complètement couverts.

Figure 2 : Observation par intervalles de temps réguliers de CSE de souris marquées par le FUCCI (CA) 2.1

Conditions d’imagerie
Échantillon : CSE murines 
Objectif : objectif à immersion dans l’huile de silicone (UPLSAPO30XS) 
Microscope : système FLUOVIEW FV3000
Laser : 445 nm (AmCyan), 594 nm (mCherry)

Détection d’une phase G1 courte

Le FUCCI (CA) marque entièrement la phase G1 par un signal rouge intense qui permet de mesurer précisément les limites de la phase, même dans les CSE non différenciées en prolifération rapide. Grâce à l’observation par intervalles de temps réguliers au niveau de chaque cellule, on a pu déterminer que les CSE murines (CSEm) prolifèrent avec un temps de doublement d’environ 11 heures et une phase G1 d’une heure seulement.

Figure 3 : Profils temporels des intensités de fluorescence (F.I.) du noyau de cellules uniques exprimant le FUCCI (CA) 2.1

Figure 3 : Profils temporels des intensités de fluorescence (F.I.) du noyau de cellules uniques exprimant le FUCCI (CA) 2.1

Caractéristiques techniques du FV3000 ayant permis cette expérience

Le système intégralement spectral permet une sensibilité élevée

La gamme FV3000 repose sur la technologie de détection TruSpectral d’Olympus, qui diffracte la lumière en la transmettant à travers une unité holographique de phase volumique. Cette technologie permet d’obtenir une luminosité largement supérieure par rapport aux unités de détection spectrale conventionnelles équipées de réseaux de type à réflexion.

Rapport signal-bruit (S/N) élevé avec une faible lumière d’excitation

Le détecteur à haute sensibilité du FV3000 possède jusqu’à quatre canaux de tubes photomultiplicateurs GaAsP qui capturent les signaux fluorescents faibles à une efficacité quantique maximale de 45 %. De plus, le refroidissement par effet Peltier dans ces détecteurs réduit le bruit de fond de 20 %. Ensemble, ces caractéristiques techniques permettent une imagerie avec un rapport signal-bruit élevé, même lorsque la lumière d’excitation est faible.

Acquisition d’images du cycle cellulaire physiologiquement exactes : commentaire du Dr Asako Sakaue-Sawano

Les CSEm non différenciées se divisent et se déplacent dans un espace de culture cellulaire tridimensionnel (3D), ce qui nécessite le recours à l’imagerie XYZT pour suivre leur prolifération. Dans l’imagerie par intervalles de temps réguliers, un balayage laser répété peut induire des altérations du cycle cellulaire des CSEm non différenciées en raison de leur importante sensibilité à la phototoxicité. Le système de microscope FV3000 a permis au Dr Asako Sakaue-Sawano et à ses collègues de réaliser des expériences d’imagerie quadridimensionnelles (XYZT) sûres pour les échantillons afin de caractériser précisément la totalité du cycle cellulaire avec une phase G1 très courte des CSE murines en prolifération rapide au niveau de chaque cellule.

Remerciements
Cette note d’application a été rédigée avec l’aide des chercheurs suivants :
Dr Masahiro Yo (responsable des expériences d’imagerie), Laboratory for Cell Function Dynamics, RIKEN Center for Brain Science

Dr. Masahiro Yo

Dr. Masahiro Yo
(Responsable des expériences d'imagerie)

Dr. Asako Sakaue-Sawano

Dr Asako Sakaue-Sawano
(Première auteure)

Dr. Atsushi Miyawaki

Dr Atsushi Miyawaki
(Directeur de rechercher)

Référence
Pour en savoir plus sur les études mentionnées dans la présente note d’application, veuillez consulter l’article suivant :
A. Sakaue-Sawano, et al. « Genetically Encoded Tools for Optical Dissection of the Mammalian Cell Cycle. » Molecular Cell, volume 68, numéro 3 (octobre 2017) : pp. 626–640.e5.

Appareil requis pour cette application

Microscope confocal à balayage laser

FV3000

  • Disponible en configuration galvanomètre seul (FV3000) ou hybride galvanomètre / résonant (FV3000RS)
  • Nouvelle détection TruSpectral haute efficacité et grande précision pour tous les canaux
  • Optimisé pour la prise d’images de cellules vivantes avec une sensibilité élevée et une faible phototoxicité
  • Inverted and upright frame options to suit a variety of applications and sample types
Objectifs super apochromatiques

UPLSAPO-S/UPLSAPO-W

  • Compensation des aberrations sphériques et chromatiques et transmission élevée de la région du visible jusqu’à la région du proche infrarouge.
  • Indice de réfraction de l’eau ou de l’huile de silicone similaire à celui de la cellule vivante et très efficace pour l’imagerie de cellules vivantes.

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