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Note d’application

Comparaison de lignées de cellules souches pluripotentes induites (SPi) humaines à l'aide du système de surveillance de l'incubation CM20 (partie 3) : réduction des variations de l'efficacité de la différenciation des organoïdes hépatiques entre les lignées de cellules SPi


Introduction

Les organoïdes sont des tissus en trois dimensions créés in vitro à partir de cellules souches pluripotentes induites (SPi) humaines. Même si les organoïdes issus de plusieurs donneurs différents doivent être étudiés pour mettre en avant les différences fonctionnelles et individuelles entre eux, les variations observées entre les lignées de cellules SPi limitent leurs applications. L'objectif de cette étude est d'utiliser le système de surveillance de l'incubation CM20 afin de découvrir les signaux morphométriques nécessaires pour définir la dépendance de l'efficacité de la formation des organoïdes au donneur et au clone.

Analyse des données pour chaque prolifération de lignées de cellules SPi humaines acquises grâce au système de surveillance de l'incubation CM20

Lors de la première phase d'étude, 12 lignées de cellules SPi humaines issues de 12 donneurs différents ont été conservées à l'état indifférencié et surveillées grâce au système de surveillance de l'incubation Olympus CM20. Grâce à la surveillance quantitative et à long terme de l'état cellulaire, nous avons pu constater des différences entre les lignées de cellules SPi au niveau de leur processus de croissance et de leur vitesse de croissance entre chaque état.

Lors de l'étape suivante de notre étude, nous avons différencié les 12 lignées de cellules SPi humaines en organoïdes hépatiques et nous nous sommes demandés s'il était possible d'observer des variations entre chaque lignée de cellules SPi humaines au niveau de la formation et de l'efficacité de la différenciation des organoïdes. Nous avons révélé que l'efficacité de la différenciation en organoïdes est fortement affectée par les différences observées au tout début du stade de prolifération, lors de la culture de maintien. Toutefois, les différences remarquées entre chaque lignée de cellules SPi, au niveau du temps de doublement, ne nous ont pas permis d'établir si les organoïdes hépatiques formés étaient de bonne ou de mauvaise qualité.

Afin de faire progresser les connaissances en vue d'améliorer nos méthodes de différenciation des organoïdes hépatiques, nous avons utilisé les données relatives à la croissance cellulaire acquises au cours de la première phase de notre étude, pendant les cultures de maintien, grâce au système de surveillance de l'incubation CM20. Nous nous sommes alors concentrés sur deux lignées de cellules SPi en particulier qui présentaient une efficacité de différenciation en organoïdes hépatiques faible afin de mieux comprendre pourquoi ces deux lignées s'étaient comportées différemment par rapport aux autres lignées cellulaires. Nous nous sommes demandés s'il était possible d'améliorer l'efficacité de différenciation des cellules SPi résistantes à la différenciation en modifiant les conditions de culture de maintien.

Résultats

Parmi les 12 lignées de cellules SPi testées jusqu'à présent, nous avons pu observer que les lignées cellulaires I et J étaient résistantes à la différenciation en lignées hépatiques. Pour mieux en comprendre les raisons, nous avons utilisé une série d'images acquises grâce au système de surveillance CM20 pendant le premier stade de la culture de maintien et avons essayé de trouver des différences dans les comportements des lignées cellulaires I et J par rapport aux lignées de cellules SPi capables de se différencier en lignées hépatiques.

Il est intéressant de noter que les colonies des lignées de cellules SPi capables de se différencier seules (par exemple, la lignée L) étaient surtout composées de cellules simples ayant adhéré entre elles juste après le passage au stade de prolifération. D'un autre côté, nous avons observé que le taux de mort cellulaire sur les lignées cellulaires I et J était plus élevé après l'adhérence, ce qui a entraîné une baisse notable de l'efficacité de formation des colonies (illustration 1). Cette tendance a été observée à de nombreuses reprises au cours de différents passages. À partir de ces observations, nous avons émis l'hypothèse qu'une fréquence de mort cellulaire plus élevée lors des premiers stades de la culture de maintien sur des lignées de cellules SPi résistantes à la différenciation pouvait être la cause du nombre moins élevé de colonies de cellules SPi observées sur ces lignées, se traduisant ainsi par une baisse de l'efficacité de différenciation desdites lignées en organoïdes hépatiques.

Pour le vérifier, nous avons augmenté le nombre de cellules ensemencées au moment du passage au stade suivant afin que le nombre final de colonies soit équivalent à celui des lignées de cellules SPi se différenciant normalement. Nous avons ensuite tenté de différencier les cellules de cette culture en organoïdes hépatiques. Nous avons prouvé que la multiplication par 5 à 10 fois du nombre de cellules ensemencées au moment du passage au stade suivant permettait d'augmenter le nombre de colonies formées à partir d'une culture de maintien des cellules SPi résistantes à la différenciation par rapport au protocole standard (illustration 2A). En outre, lorsque les organoïdes hépatiques étaient formés dans ces conditions à partir des lignées cellulaires I et J, nous formions suffisamment d'organoïdes en comparaison aux conditions de culture précédentes où seuls quelques organoïdes étaient générés (illustration 2B). Nous avons également remarqué que ces organoïdes hépatiques permettaient d'exprimer de nombreux marqueurs hépatiques. Ces résultats mettent en lumière l'importance des données acquises grâce au système de surveillance des cultures cellulaires CM20 afin d'apporter des améliorations, au cours du premier stade, à la culture de maintien des cellules SPi résistantes à la différenciation et, par la suite, à la différenciation desdites cellules en organoïdes hépatiques.

Lignée cellulaire I

Lignée cellulaire I

Lignée cellulaire J

Lignée cellulaire J

Lignée cellulaire L

Lignée cellulaire L

Illustration 1. Comportements des lignées de cellules SPi humaines lors des premiers stades de la culture de maintien.

(A) Résultats du processus de croissance des trois lignées de cellules SPi humaines dans des conditions normales de culture et de la culture de maintien dans des conditions où le nombre d'ensemencements est plus important obtenus grâce au système de surveillance CM20

(B) Cette illustration montre la formation d'organoïdes lorsque la différenciation est réalisée après la mise en culture de maintien des lignées cellulaires I et J résistantes à la différenciation en utilisant des conditions de culture où le nombre de cellules ensemencées a été augmenté. Elle montre également, à titre de comparaison, les organoïdes formés à partir de la lignée cellulaire L, une lignée de cellules SPi capable de se différencier seule, lorsque celle-ci est maintenue dans des conditions normales de culture, puis se différencie.

Illustration 2. Effet de la densité d'ensemencement sur la formation des organoïdes pendant la culture de maintien des cellules SPi.
(A) Résultats du processus de croissance des trois lignées de cellules SPi humaines dans des conditions normales de culture et de la culture de maintien dans des conditions où le nombre d'ensemencements est plus important obtenus grâce au système de surveillance CM20.
(B) Formation d'organoïdes lorsque la différenciation est réalisée après la mise en culture de maintien des lignées cellulaires I et J résistantes à la différenciation en utilisant des conditions de culture où le nombre de cellules ensemencées a été augmenté. Cette illustration montre également, à titre de comparaison, le nombre d'organoïdes formés à partir de la lignée cellulaire L, une lignée de cellules SPi capable de se différencier seule, lorsque celle-ci est maintenue dans des conditions normales de culture, puis se différencie.

Conclusion

Les chercheurs travaillant avec des organoïdes concentrent bien souvent leurs efforts sur l'optimisation des protocoles de différenciation des organoïdes à partir de cellules SPi. Lors de la comparaison des organoïdes issus de nombreuses lignées de cellules SPi, la majorité des chercheurs prête rarement attention à leurs cultures de maintien. Cette étude a permis de montrer que le stade initial de prolifération lors de la culture de maintien des cellules SPi a une très grande influence sur l'efficacité de la différenciation qui en résulte. Outre la mise au point d'un protocole de différenciation des organoïdes, cette étude laisse entendre que l'optimisation des protocoles de culture de maintien des cellules SPi est essentielle pour produire de manière reproductible de nombreux échantillons d'organoïdes. Grâce au système de surveillance de l'incubation CM20, qui est capable de stocker et de gérer les données de culture chronologiques et longitudinales, nous pouvons acquérir de nouvelles connaissances et améliorer nos protocoles d'expérimentation.

Commentaires du Dr Takebe et du Dr Yoneyama

Dr Takanori Takebe (à gauche) Dr Yosuke Yoneyama (à droite)

Dr Takanori Takebe (à gauche)
Dr Yosuke Yoneyama (à droite)
Université de médecine et d’odontologie de Tokyo (Tokyo Medical and Dental University) 
Institut de recherche

Grâce à l'une de ses principales fonctionnalités, le système de surveillance de l'incubation CM20 nous permet d'associer immédiatement les organoïdes formés à la pile des précédentes images pour évaluer le stade des cellules SPi. Ce système fut un atout majeur pour notre laboratoire puisqu'il était capable de nous informer sur les conditions de culture pendant la maintenance des cellules SPi et d'identifier l'attribut critique pour l'amélioration de l'efficacité de la différenciation.

Produits utilisés pour cette application

Système de surveillance de l’incubation

CM20

  • Collecte automatique de données quantitatives relatives à la viabilité et à la confluence de vos cultures
  • Surveillez, analysez et partagez à distance la progression de vos cultures depuis un ordinateur ou une tablette 
  • Équipé de la technologie d’épi-illumination en oblique pour une observation sans marquage
Système de surveillance de l’incubation

CM30

Utilisez le système de surveillance de l’incubation CM30 automatisé pour recueillir à distance des données quantitatives fiables sur la viabilité, la numération et la confluence de vos cellules en culture, et pour les analyser et les partager. Ce système permet une observation sans marquage, réduit le risque d’endommagement de vos cultures et standardise votre processus de culture.

  • Collecte automatique de données quantitatives sur la viabilité et la confluence de vos cultures
  • Surveillance, analyse et partage à distance de la progression des cultures depuis un ordinateur ou une tablette
  • Éclairage épiscopique oblique intégré pour l’observation sans marquage

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