Numération cellulaire : mesure du nombre de cellules dans les sphéroïdes

L’observation au microscope confocal associée au logiciel d’analyse cellulaire 3D NoviSight permet de compter le nombre de cellules dans des sphéroïdes à partir d’images de coupes optiques des sphéroïdes.

Objectifs

La connaissance du nombre exact de cellules constitue l’un des paramètres les plus importants dans les analyses réalisées sur des cellules. Cela est également le cas pour l’analyse des sphéroïdes. Il est possible de dénombrer les cellules d’un sphéroïde à l’aide d’un hémocytomètre et d’une suspension cellulaire préparée par dissolution du sphéroïde avec de la trypsine, mais cette technique implique la perte des caractéristiques liées à la structure 3D du sphéroïde. Au cours de cette étude, la numération non destructive des cellules des sphéroïdes a été réalisée selon la procédure suivante : le nombre de cellules présentes sur des images de coupes optiques des sphéroïdes a été déterminé par observation au microscope confocal associée à l’utilisation du système d’analyse cellulaire. Les résultats ont été comparés à ceux obtenus avec un hémocytomètre.

Préparation des échantillons

Du milieu de culture a été ensemencé par une suspension de cellules HeLa ou HT-29 dans une microplaque de 96 puits à fond en U PrimeSurface® (SUMITOMO BAKELITE CO., LTD) à raison d’une densité d’ensemencement de 500 cellules/puits. Chaque sphéroïde a été prélevé 48 heures après le début de la culture cellulaire. La moitié du tissu de chaque sphéroïde a été fixée au formol à 4 %. Les tissus fixés ont ensuite été marqués au Hoechst 33342 puis clarifiés toute la nuit.1 La moitié de tissu restante de chaque sphéroïde a été traitée à la trypsine pendant une nuit afin de préparer la suspension cellulaire.

1) Susaki et.al. Cell. 2014 Apr 24;157(3):726-39. doi: 10.1016/j.cell.2014.03.042. Epub 2014 Apr 17

Conclusion
Numération cellulaire réalisée à l’aide du système d’analyse cellulaire et de l’hémocytomètre

Les images en fluorescence des sphéroïdes susmentionnés ont été acquises à l’aide du système d’analyse cellulaire. (Ex : 405 nm, Em : 488 nm). Pour compter le nombre de cellules, le système prend des images de coupes optiques des sphéroïdes tous les 20 µm, puis identifie et compte les noyaux des cellules visibles (figure 1^*). Ensuite, les nombres de noyaux sont additionnés pour estimer le nombre total de cellules présentes dans le sphéroïde (numération avec le système). Les résultats, présentés dans la figure 2 (barres : écart-type, n=6), ont été comparés à ceux obtenus à l’aide d’un hémocytomètre (comptage manuel). Ces résultats ont montré que le système permet la numération des cellules de sphéroïdes tout en conservant leur intégrité structurelle.

PrimeSurface est une marque déposée de Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
Olympus est une marque déposée, et NoviSight, Insightful Analysis et Intelligent Answers sont des marques de commerce d’Olympus Corporation.

* Bien que la lignée cellulaire HeLa soit devenue l’une des plus importantes dans la recherche médicale, nous devons absolument reconnaître que la contribution de Henrietta Lacks à la science s’est produite sans son consentement. Cette injustice, bien qu’elle ait mené à des découvertes clés en immunologie, en maladies infectieuses et en cancer, a également suscité d’importantes conversations sur la confidentialité, l’éthique et le consentement en médecine.
Pour en savoir plus sur la vie de Henrietta Lacks et sur sa contribution à la médecine moderne, cliquez ici.
http://henriettalacksfoundation.org/