Analyse d’images en fluorescence : analyse des cellules vivantes et des cellules mortes dans les sphéroïdes

La relation entre le nombre de cellules mortes à l’intérieur de sphéroïdes et l’efficacité d’un médicament peut être évaluée quantitativement à l’aide d’un microscope confocal et du module de numération cellulaire du logiciel NoviSight™.

Objectifs

L’existence d’un gradient de diffusion de l’oxygène ou des nutriments entre la surface et le centre d’une tumeur créer environnement difficile qui entraîne la mise en repos ou la mort des cellules situées en profondeur dans la tumeur. Un modèle sphéroïde permet de refléter fidèlement le microenvironnement tumoral. Par le passé, pour observer l’intérieur des échantillons 3D, il fallait préparer toute une série de coupes séparément. Désormais, grâce à la mise au point d’une technologie de clarification des tissus, il est possible d’observer l’intérieur des échantillons 3D tout en préservant leur intégrité structurelle. Au cours de cette étude, les images confocales de sphéroïdes tumoraux marqués par fluorescence, traités par un médicament, fixés et clarifiés ont fait l’objet d’une analyse quantitative 3D à l’aide du logiciel NoviSight™. L’étude a permis de montrer que la mort cellulaire induite ou non par un médicament peut être confirmée grâce à un réactif de clarification et au logiciel NoviSight™.

Préparation des échantillons

Du milieu de culture a été ensemencé avec une suspension de cellules HT-29 dans une microplaque de 96 puits PrimeSurface® (SUMITOMO BAKELITE CO., LTD) à fond en U, à raison d’une densité d’ensemencement de 500 cellules/puits. Huit jours après la mise en culture, de la staurosporine (STS) à différentes concentrations ainsi que du NucView550 ont été ajoutés dans chaque puits. Après une incubation d’une journée, les cellules ont été fixées au paraformaldéhyde à 4 % et perméabilisées avec du PBS contenant 0,5 % de TritonX-100. Ensuite, les noyaux cellulaires ont été marqués au Hoechst 33342 à 4 °C pendant une nuit, puis les sphéroïdes ont été clarifiés avec du ScaleS.

Conclusion
Acquisition et analyse des images en fluorescence

Des images confocales en fluorescence des sphéroïdes susmentionnés ont été acquises à l’aide du microscope confocal à balayage laser FV3000.  Même en l’absence de STS, les noyaux des cellules situées en profondeur dans les sphéroïdes ont été marqués au NucView 550 (A), ce qui indique que l’apoptose a lieu. La reconnaissance des noyaux cellulaires et l’analyse du nombre des cellules avec le logiciel NoviSight™ permettent de quantifier le taux de cellules mortes (B) et de confirmer que la mort cellulaire induite par la STS est dépendante de la dose de STS (C, D). Ces résultats illustrent comment le logiciel NoviSight™ peut contribuer à l’évaluation quantitative de la mort cellulaire spatiale induite par des médicaments.

PrimeSurface est une marque déposée de Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
Olympus est une marque déposée, et NoviSight, Insightful Analysis et Intelligent Answers sont des marques de commerce d’Olympus Corporation.