Pendant mon temps passé chez Olympus, j’ai eu plusieurs occasions de m’émerveiller devant la créativité des configurations de microscopes confocaux de nos clients, des porte-échantillons faits maison aux équipements expérimentaux. Et comme notre microscope confocal FV3000 est disponible en configuration droite et inversée, il est possible de disposer et d’orienter les échantillons de très nombreuses manières.
Le microscope FV3000 est conçu pour l’observation en fluorescence. Mais avec un peu d’ingéniosité, il est aussi possible de l’utiliser pour de l’imagerie confocale par réflectance. La technique d’imagerie confocale par réflectance est souvent sous-estimée, malgré sa polyvalence et son côté pratique, c’est pourquoi je vais vous présenter une façon astucieuse de l’utiliser pour profiter au mieux de votre système.
J’expliquerai comment utiliser l’imagerie confocale par réflectance pour extraire des informations endogènes des tissus biologiques.
Imagerie confocale par réflectance de complexes biomoléculaires fibrillaires
Un trajet optique de réflectance permet, entre autres, de capturer des signaux endogènes pour plus de contraste et une meilleure perception de l’environnement de l’échantillon.
Voici comment cela fonctionne : l’interface entre les structures des protéines fibrillaires biologiques et l’eau produit un signal de contraste fortement réfléchissant. En captant la lumière d’excitation à l’aide d’un détecteur TruSpectral réglé sur une largeur de bande coïncidant avec celle de la lumière d’excitation, il est possible d’identifier des structures cellulaires spécifiques, l’organisation de la matrice extracellulaire environnante ou les caractéristiques de la surface de l’échantillon.
Comme le microscope confocal FV3000 comporte un trajet optique pouvant conduire la totalité du spectre lumineux, il est possible d’utiliser chaque canal pour la détection de la lumière réfléchie. Combinée à vos observations en fluorescence, cette nouvelle capacité de réflectance multispectrale permet d’extraire la localisation de structures cellulaires non marquées.
Par exemple, imaginons une lame avec une coupe de cerveau de rat fixée et marquée par immunofluorescence fournie par EnCor Biotechnology, Inc. Comme vous pouvez le voir dans les images ci-dessous (figure 1), une acquisition VBF standard sur trois canaux révèle un excellent marquage spécifique des épitopes des dendrites neuronales (orange), des neurones catécholaminergique (violet) contenant de la dopamine ou de la norépinéphrine et le fluorophore intercalant permettant de distinguer les noyaux (bleu).
Figure 1 : coupe de cerveau de rat marquée par immunofluorescence tricolore par EnCor Biotechnology, Inc. Rangée du haut : image en champ complet d’un plan Z unique acquise avec un objectif X Line 20X. Rangée du bas : résolution pixel réelle d’un médaillon.
Malgré un fort bruit de fluorescence à large spectre créé par la préparation d’immunofluorescence, il est possible d’utiliser la réflectance pour extraire davantage d’informations endogènes.
En utilisant quatre canaux simultanément pour imager la réflectance des lignes laser à 405, 488, 561 et 640 nm, il est possible de créer une carte multispectrale des neurones myélinisés dans ce tissu. Vous pouvez observer le résultat dans les images ci-dessous (figures 2 et 3).
 Figure 2 (gauche) : fusion des trois canaux d’acquisition des signaux dérivés de l’immunofluorescence illustrés dans la figure 1. Droite : même champ d’observation avec fusion des images confocales, acquises simultanément par quatre canaux, de la réflectance des lignes laser à 405, 488, 561 et 640 nm. |  Figure 3 (haut) : images confocales individuelles, acquises simultanément, de la réflectance de chaque ligne. Bas : images fusionnées de neurones contenant de la dopamine marqués par immunofluorescence, et image confocale de la réflectance multispectrale de la myélinisation d’axones endogènes. |
Vous pouvez utiliser ces informations sans marquage pour estimer le degré de myélinisation des neurones d’intérêt qui ont été spécifiquement marqués par immunofluorescence ou pour des applications nécessitant un suivi des axones.
L’imagerie confocale par réflectance peut également servir à mettre en évidence la matrice extracellulaire de modèles de tissus cultivés en 3D. Comme vous pouvez le voir dans les images ci-dessous (figure 4), les néovaisseaux qui se développent pendant l’angiogenèse interagissent étroitement avec les fibrilles de collagène environnantes du stroma.
Figure 4 : projection Z d’un vaisseau sanguin en impression 3D dans une matrice collagénique. Haut : image confocale par fluorescence de cellules endothéliales marquées à la rhodamine. Milieu : image confocale par réflectance à 405 nm représentant le réseau de collagène fibrillaire et les zones de remodelage proximales par rapport au vaisseau. Bas : image fusionnée. Échelle graphique : 100 µm.
L’observation au microscope confocal FV3000 de la reproduction in vitro d’une angiogenèse native à partir de microvaisseaux isolés Angiomics™d’Advanced Solutions Life Sciences révèle clairement que les néovaisseaux angiogéniques (visualisés par fluorescence confocale) réorganisent les fibrilles de collagène directement adjacentes (visualisées avec une imagerie par réflectance) pendant leur développement dans le stroma 3D.
