Les microscopes à balayage laser confocaux sont des outils très prisés en biologie expérimentale. Ils sont communément utilisés pour l’imagerie simultanée de plusieurs fluorophores nécessitant une bonne séparation des couleurs et pour l’imagerie en profondeur dans les échantillons biologiques requérant d’excellentes capacités de sectionnement.
Aujourd’hui, les dernières innovations en matière de technologie laser peuvent améliorer de telles applications et rendre possible des expériences encore plus complexes. Dans cet article de blogue, nous allons aborder la façon dont les nouveaux lasers d’excitation dans le proche infrarouge (NIR) sur nos microscopes confocaux FV3000 facilitent les applications de multiplexage avancées.*
Les obstacles au multiplexage avec plus de cinq canaux dans la microscopie confocale et comment les surmonter
Commençons par court exposé de l’histoire des expériences à multiplexage.
Pendant des années, de nombreux chercheurs réalisaient leurs expériences en immunofluorescence avec le DAPI et deux autres couleurs, généralement dans les spectres du vert et du rouge.
Les anticorps et les systèmes d’imagerie ont évolué, avec plus de détecteurs et un meilleur filtrage des longueurs d’onde d’émission, et l’immunofluorescence à quatre couleurs a gagné du terrain. Le DAPI, le vert, le rouge et le rouge lointain étaient la combinaison de quatre couleurs la plus courante.
Cependant, deux facteurs essentiels empêchaient l’arrivée d’un cinquième canal pour le multiplexage.
1. Un manque de diodes laser NIR avec un faisceau de bonne qualité.
Tout d’abord, les diodes laser NIR avec un faisceau de bonne qualité pour les microscopes à balayage laser confocaux n’étaient pas aisément disponibles. Une puissance suffisante (sans être excessive), des fluctuations de puissance minimales et des profils de faisceau compatible sont autant de paramètres nécessaires pour les diodes laser utilisées dans l’imagerie confocale. Le choix de diodes laser NIR dans ces plages de longueurs d’onde était cependant très restreint jusqu’à il y a quelques années.
Mais tout cela a changé grâce aux dernières technologies de diode laser. Notre microscope confocal FV3000 est désormais équipé de diodes laser à 730 et 785 nm pour une excitation efficace de fluorophores secondaires, tels que :
- la Cyanine7 (Cy7)
- l’Alexa Fluor 750
- l’Alexa Fluor 790
- le DyLight 800
- l’IRDye 800
- le vert d’indocyanine (ICG)
La disponibilité de ces fluorophores, et du nombre croissant de fluorophores en cours de développement, renforce l’intérêt de l’ajout d’un cinquième et d’un sixième canal simultané pour le multiplexage.
2. Des tubes photomultiplicateurs avec une faible sensibilité dans les longueurs d’onde du NIR.
Le deuxième obstacle provient du fait que de nombreux tubes photomultiplicateurs (PMT) ont une faible sensibilité pour la détection de longueurs d’onde typiquement utilisées pour l’excitation à 730 et 785 nm.
Cette faible sensibilité dans la détection du proche infrarouge se fait particulièrement sentir avec les très répandus PMT GaAsP, dont la sensibilité est supérieure sur le milieu du spectre visible. Dans la plage des 750 nm et plus, les détecteurs GaAsP ont une très mauvaise sensibilité.
Pour compenser ce problème, nous avons intégré des détecteurs GaAs décalés vers le rouge dans notre microscope laser confocal FV3000.
Notre système FV3000 propose désormais des détecteurs GaAs dans de nombreuses combinaisons, avec des PLT multi-alcalins (standard) et GaAsP (haute sensibilité). Ces configurations peuvent utiliser les détecteurs GaAs comme cinquième ou sixième canal* pour les applications de multiplexage. (*Certaines limitations s’appliquent)
Combiné à nos objectifs haute performance X Line, notre système FV3000 peut offrir une correction de haute qualité de l’aberration chromatique sur une large plage de 400 à 1 000 nm. Cela permet de bénéficier d’une bien meilleure reproductivité chromatique tant pour l’imagerie en fond clair que l’imagerie en fluorescence multicolore.
*Il s’agit d’une solution sur mesure qui n’est pas disponible dans toutes les régions. Veuillez contacter votre représentant Olympus pour plus d’informations.
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