Les microscopes à balayage laser confocaux sont des outils très prisés en biologie expérimentale. Ils sont communément utilisés pour l’imagerie simultanée de plusieurs fluorophores nécessitant une bonne séparation des couleurs et pour l’imagerie en profondeur dans les échantillons biologiques requérant d’excellentes capacités de sectionnement.
Aujourd’hui, les dernières innovations en matière de technologie laser peuvent améliorer de telles applications et rendre possibles des expériences encore plus complexes. Dans cet article de blogue, nous allons aborder la façon dont les nouveaux lasers d’excitation dans le proche infrarouge (NIR) sur nos microscopes confocaux FV4000 facilitent les applications de multiplexage avancées.*
Multiplexage avec plus de cinq canaux en microscopie confocale : surmonter les défis techniques grâce au système FV4000
Commençons par un court exposé de l’histoire des expériences de multiplexage.
Pendant des années, de nombreux chercheurs ont réalisé leurs expériences d’immunofluorescence avec le DAPI et deux autres couleurs, généralement dans les spectres du vert et du rouge.
À mesure que les systèmes d’imagerie se sont perfectionnés avec plus de détecteurs et un meilleur filtrage des longueurs d’onde d’émission, l’immunofluorescence à quatre couleurs a gagné du terrain. L’association du DAPI à des couleurs dans les spectres du vert, du rouge et de l’infrarouge dans une même image était l’association à quatre couleurs la plus courante à l’époque.
Toutefois, deux facteurs critiques empêchaient l’addition d’un cinquième ou d’un sixième canal pour le multiplexage :
1. Un manque de diodes laser proche infrarouge avec un faisceau de bonne qualité
Tout d’abord, les diodes laser proche infrarouge avec un faisceau de bonne qualité pour les microscopes à balayage laser confocaux n’étaient pas largement disponibles. Une puissance suffisante (sans être excessive), une fluctuation de puissance minimale et des profils de faisceau compatibles sont autant de paramètres nécessaires pour les diodes laser utilisées en imagerie confocale. Toutefois, seuls quelques modèles de diodes laser proche infrarouge étaient disponibles sur ces plages de longueurs d’onde jusqu’à récemment.
Mais tout cela a changé grâce aux dernières technologies de diode laser. Notre microscope confocal FV4000 est désormais équipé de diodes laser à 685, 730 et 785 nm pour une excitation efficace des fluorophores secondaires, comme ceux indiqués dans le tableau ci-dessous.
| Laser | Fluorophore | λ ex. (nm) | λ ém. (nm) |
|---|---|---|---|
| LD685 | Alexa Fluor 680 | 679 | 702 |
| DyLight 680 | 692 | 712 | |
| Alexa Fluor 700 | 696 | 719 | |
| iRFP720 | 702 | 720 | |
| LD730 | ATTO 740 | 743 | 763 |
| DiR | 750 | 782 | |
| Alexa Fluor 750 | 752 | 779 | |
| Cy7 | 753 | 775 | |
| DyLight 755 | 754 | 776 | |
| LD785 | DyLight 800 | 777 | 794 |
| IR Dye 800CW | 778 | 794 | |
| Alexa Fluor 790 | 782 | 805 | |
| Cy7.5 | 790 | 810 |
La disponibilité de ces fluorophores, et du nombre croissant de fluorophores en cours de développement, renforce l’intérêt de l’addition d’un cinquième et d’un sixième canal simultané pour le multiplexage.
2. Des tubes photomultiplicateurs avec une faible sensibilité aux longueurs d’onde proche infrarouge
Le second défi auquel nous avons dû faire face pour rendre l’imagerie proche infrarouge efficace fut que de nombreux tubes photomultiplicateurs, qui étaient utilisés comme détecteurs standard sur les microscopes confocaux à balayage laser, avaient une sensibilité réduite à la plage des longueurs du proche infrarouge à détecter (au-dessus de 750 nm).
Cette faible sensibilité au proche infrarouge se fait particulièrement sentir avec les très répandus PMT GaAsP, dont la sensibilité est supérieure sur le milieu du spectre visible. Sur la plage des 750 nm et plus, les détecteurs GaAsP ont une très faible sensibilité.
Pour surmonter ce défi, nous avons équipé notre microscope confocal à balayage laser FV4000 de la technologie de détection SilVIR. Notre détecteur SilVIR est doté d’un photomultiplicateur au silicium (SiPM). Il s’agit d’un capteur à semi-conducteur capable d’acquérir des images de fluorescence avec un excellent rapport signal/bruit sur une large plage de longueurs d’onde allant de 400 à 900 nm.
Grâce à cette technologie, notre système FV4000 vous permet de disposer d’un détecteur SilVIR à six canaux pour vos applications en multiplexage. Combiné à nos objectifs à haute performance X Line™, le système FLUOVEW™ FV4000 permet une correction de haute qualité des aberrations chromatiques sur une plage étendue allant de 400 à 1000 nm. L’association des détecteurs SilVIR aux objectifs X-Line™ assure une meilleure fiabilité de l’imagerie de fluorescence multiplex et de l’imagerie proche infrarouge.
*Cet article a été mis à jour à partir du contenu de l’article original publié le 21 janvier 2020.
