Penser au-delà de la fluorescence : l’imagerie biologique avec la microscopie SHG et THG

Dans la recherche moderne en sciences de la vie, la microscopie de fluorescence est une technique d’imagerie puissante et de plus en plus utilisée. Avec le marquage spécifique d’une cible par un fluorophore, le signal de fluorescence émis permet d’obtenir une image avec un excellent contraste et un bruit de fond minimal jusqu’au niveau moléculaire.

Les technologies optiques hautement développées, ainsi que les approches de marquage largement répandues, à commencer par l’ingénierie génétique de pointe, sont les facteurs du succès de la microscopie de fluorescence en recherche biologique.

Et pourtant, malgré ce bilan plutôt positif, le manque de molécules ou de marqueurs fluorescents limite toujours les applications de microscopie de fluorescence :

• De nombreuses biomolécules sont non fluorescentes, petites et facilement perturbées par les marqueurs fluorescents
• Le niveau d’expression et la spécificité des fluorophores dans les organismes vivants compliquent parfois les résultats expérimentaux
• L’utilisation de marqueurs fluorescents exogènes suscite des inquiétudes en ce qui concerne la recherche biomédicale chez l’homme

Étant donné ces limites, les méthodes d’imagerie optique qui utilisent le contraste plutôt que la fluorescence sont très demandées. Dans cet article, nous vous présenterons des méthodes d’imagerie biologiques alternatives pour vous aider à penser au-delà de la microscopie de fluorescence et élargir vos capacités de recherche.

Penser au-delà de la microscopie de fluorescence

L’optique non linéaire peut générer des signaux à partir des propriétés intrinsèques de molécules spécifiques et former une image contrastée sans recourir à la fluorescence.

Grâce à la disponibilité des sources laser et des technologies de microscopie avancées, l’optique non linéaire n’est pas seulement destinée aux expériences complexes. Elle est devenue une solution d’imagerie biologique tout à fait praticable, qui pousse les chercheurs à penser au-delà de la microscopie de fluorescence. La microscopie de génération d’harmonique (HG) optique en est un bon exemple.

Comprendre la microscopie SHG et THG

Pour faire simple, la génération d’harmonique est un processus optique non linéaire dans lequel n photons interagissent simultanément avec la matière et se convertissent en un photon unique. La génération de seconde harmonique (SHG, deux photons convertis en un photon) et la génération de troisième harmonique (THG, trois photons convertis en un photon) sont les microscopies HG les plus utilisées en imagerie biologique.

Le processus de conversion des photons de la SHG et de la THG est illustré dans le diagramme de Jablonski (figure 1) ci-dessous : la SHG génère des photons avec une énergie photonique double (demi-longueur d’onde), et la THG génère des photons avec une énergie photonique triple (un tiers de longueur d’onde) de celle des photons d’excitation.

Figure 1 : diagramme de Jablonski des processus optiques de SHG et de THG. Les lignes pointillées représentent les états virtuels.

Comme la microscopie multiphotonique, la SHG et la THG nécessitent une source laser pulsée ultrarapide, en général d’une plage de longueurs d’onde dans le proche IR, pour accomplir le processus optique non linéaire sur un petit volume focal d’excitation. Par conséquent, les microscopies de SHG et de THG bénéficient des propriétés suivantes :

• Une capacité de sectionnement optique intrinsèque
• Une capacité d’imagerie profonde sur des tissus à forte diffusion
• Un faible photoblanchiment et une faible phototoxicité
• Les intensités des signaux de la SHG et de la THG sont, respectivement, proportionnelles au carré et au cube de la puissance d’excitation du laser

Cependant, contrairement à la microscopie multiphotonique, les signaux de la SHG et de la THG proviennent de la propriété optique et de la structure de l’échantillon :

• La microscopie SHG est généralement utilisée pour l’imagerie de molécules non centrosymétriques et de structures ordonnées, telles que les fibres de collagène, les microtubules, la myosine musculaire, l’amidon, les tissus cutanés et le stroma cornéen.
• La microscopie THG est généralement utilisée pour l’imagerie de substances ou interfaces à indice de réfraction élevé (comparé à l’eau environnante), telles que les organelles cellulaires, les érythrocytes ou les leucocytes, les gouttelettes lipidiques, les tissus adipeux, la gaine de myéline des axones et les os.

Sans avoir besoin d’utiliser des fluorophores, les microscopies SHG et THG permettent de faire de l’imagerie sans marqueur et de recueillir des informations moléculaires et structurelles sur des tissus biologiques, des organismes vivants et même à partir d’imagerie médicale pour le diagnostic.

Figure 2 : image de SHG/THG d’un tissu adipeux porcin non marqué prise avec le microscope multiphotonique Olympus FVMPE-RS. Le signal de SHG (cyan) représente les fibres de collagène, et le signal de THG (magenta) représente la graisse dans le tissu adipeux.

Figure 3 : circulation sanguine dans un embryon de poisson-zèbre prise avec le système multiphotonique FVMPE-RS. Le signal TGH (rouge) montre les fibres musculaires. Le signal de SHG (vert) représente les érythrocytes. Images reproduites avec l’aimable autorisation de P. Engerer du groupe Misgeld, TU Munich.

Maintenant que nous avons vu les bases des microscopies SHG et THG, nous allons vous donner quelques conseils pour vous aider à mettre en œuvre ces techniques.

Considérations pratiques pour la configuration des microscopies SHG et THG

Comme les microscopies SHG et THG peuvent partager la même source laser pulsée dans le proche IR et la même unité de balayage laser que la microscopie multiphotonique, notre microscope multiphotonique FVMPE-RS se conjugue facilement avec les microscopies SHG et THG pour créer un système d’imagerie multimode.

Voici deux considérations pratiques à prendre en compte pour configurer les microscopies SHG et THG :

1. Détection avant et détecteurs à haute sensibilité :

Alors que l’émission de fluorescence est généralement isotrope, les signaux de SHG et de THG possèdent une certaine directionnalité due au processus de mélange d’ondes. Dans la plupart des échantillons, le signal avant (qui s’éloigne de l’objectif) est bien plus fort que le signal arrière (qui va vers l’objectif). Dans un tel cas, un condenseur à grande ON et des détecteurs non descannés (NDD) transmis sont un excellent choix pour la détection du signal avant. Dans les tissus avec une forte diffusion, certains signaux avant peuvent être rétrodiffusés et détectés par la détection du signal arrière. Dans un tel cas, utilisez des NDD hautement sensibles tels qu’un tube photomultiplicateur en phospho-arséniure de gallium (GaAsP PMT) pour optimiser l’efficacité de la détection du signal arrière, surtout lorsque la détection du signal avant n’est pas utilisable sur des échantillons épais ou des animaux vivants.

2. Une bonne puissance laser à une longueur d’onde plus longue :

Le signal THG nécessite une bonne puissance d’excitation laser pour accomplir le processus optique non linéaire, et il est généré à un tiers de la longueur d’onde d’excitation. Pour une meilleure transmission et détection du signal en microscopie THG, utilisez une source laser de grande puissance à une longueur d’onde supérieure à 1 200 nm afin que le signal de THG se trouve dans la plage de la lumière visible. Par le passé, un laser pulsé dans le proche IR, un oscillateur paramétrique optique (OPO) et un opérateur très expérimenté étaient nécessaires pour générer une source laser au-delà de 1 200 nm. De nos jours, grâce aux percées en matière de technologie laser, vous pouvez générer une énorme puissance laser avec une longue longueur d’onde par vous-même à partir d’un laser pulsé ultrarapide prêt à l’emploi, tel que le Spectra-Physics InSight^® X3.

Développez vos capacités de recherche au-delà de la microscopie de fluorescence

Équipé de technologies de microscopie et de laser de pointe, notre système d’imagerie multiphotonique FVMPE-RS vous donne l’occasion de disposer des microscopies multiphotoniques, SHG et THG sur une même plateforme d’imagerie multimode. Avec ces fonctionnalités puissantes, vous pouvez développer vos capacités de recherche au-delà de la microscopie de fluorescence.