Systèmes laser pour la microscopie confocale

Les lasers couramment utilisés en microscopie confocale à balayage laser sont des sources de lumière monochromatique de haute intensité qui constituent des outils utiles pour diverses techniques, notamment les pinces optiques, l’imagerie de durée de vie de fluorescence, la récupération de fluorescence après photoblanchiment et la microscopie de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF). En outre, les lasers sont également la source de lumière la plus courante pour la microscopie confocale de fluorescence à balayage, et ils sont aussi utilisés, bien que moins fréquemment, dans les études conventionnelles de fluorescence à champ large.

Les lasers émettent des paquets intenses de lumière monochromatique qui sont cohérents, ce qui signifie que la lumière laser est en phase dans l’espace et le temps, et peut être collimatée, ou resserrée, pour former un faisceau étroit présentant un taux d’expansion très faible. Par rapport à d’autres sources de lumière, les plages de longueurs d’onde extrêmement pures émises par le laser ont une bande passante et une relation de phase inégalées par les lampes tungstène-halogène, les lampes à décharge en arc ou les générateurs de lumière à DEL. Par conséquent, les faisceaux de lumière laser peuvent parcourir de longues distances et peuvent être dilatés pour remplir des ouvertures ou focalisés sur un très petit point avec un niveau élevé de luminosité. Au-delà des similitudes communes à tous les lasers, qui comprennent un milieu d’amplification (source de lumière), une source d’excitation (alimentation électrique) et un résonateur électrique, ces sources de lumière diffèrent radicalement en matière de taille, de coût, de puissance de sortie, de qualité du faisceau, de consommation électrique ou encore de durée de vie.

La cohérence de la lumière monochromatique produite par la plupart des systèmes laser pose des problèmes dans l’application de ces sources de lumière dans le cadre de la microscopie classique en champ large. Une diffusion de la lumière et des figures de diffraction sont introduites par des interférences au niveau de chaque surface du trajet optique. En outre, les diaphragmes de champ et d’ouverture, ainsi que les saletés, produisent également des artefacts. Ces effets indésirables peuvent être minimisés ou éliminés par différentes techniques. Les méthodes les plus courantes incluent le brouillage temporaire de la lumière laser, en variant rapidement la longueur du trajet optique entre la source de lumière et le microscope, ou le balayage de l’échantillon point par point comme c’est le cas dans les systèmes de microscopie confocale. En outre, les interférences et autres artefacts peuvent souvent être éliminés par cette technique de balayage de l’ouverture. Si la longueur du trajet ou l’état de cohérence du faisceau laser fluctue à un intervalle plus rapide que le temps d’intégration du détecteur (concrètement, la fréquence d’images vidéo), les artefacts de granularité et de diffusion disparaissent de l’image.

Une technique efficace employée par certains chercheurs pour améliorer les images en contraste interférentiel différentiel (CID) produites avec une source de lumière laser à argon consiste à positionner un sabot de verre circulaire, tournant à 2500 tours par minute, dans le trajet optique. Des variations rapides de la longueur du trajet optique sont introduites par les différences d’épaisseur du sabot lorsque celui-ci tourne devant le faisceau laser dilaté. Actuellement, la variation de la longueur du trajet optique est généralement réalisée en utilisant un conduit de lumière en fibre optique pour acheminer la lumière entre la source de lumière et le microscope. La vibration des fibres produit des changements continus dans la longueur du trajet optique, ce qui entraîne une incohérence temporaire du faisceau à des fréquences inférieures à celles du niveau de vibration. Les vibrations peuvent être générées par un dispositif piézoélectrique, un haut-parleur ou le ventilateur de refroidissement utilisé dans la tête laser.

La figure 1 représente un laser pulsé titane-saphir à modes synchronisés, qui est actuellement l’une des sources d’excitation laser privilégiées dans la plupart des études de microscopie de fluorescence multiphotonique. Les lasers titane-saphir à modes synchronisés offrent une large plage de réglage de longueur d’onde, d’environ 690 à plus de 1 050 nanomètres, avec des largeurs d’impulsion d’environ 100 femtosecondes de longueur. En outre, ces lasers ont une puissance suffisante (supérieure à 100 milliwatts sur toute la plage de réglage) pour assurer la saturation de l’excitation à deux photons de la plupart des fluorophores. Pour assurer un refroidissement et un contrôle de l’humidité corrects du cristal laser, de l’azote gazeux est introduit dans la tête laser hermétique, qui est maintenue à une température constante par un refroidisseur externe.

La lumière produite par de nombreux systèmes laser est polarisée de façon linéaire, avec un vecteur de polarisation orienté verticalement. Cette propriété peut être exploitée dans les applications nécessitant une source d’éclairage polarisée, comme le contraste interférentiel différentiel, les mesures de lumière polarisée ou les études quantitatives de l’anisotropie de la polarisation de fluorescence.

La cohérence et les caractéristiques de polarisation d’un faisceau laser sont mesurées par la distribution de la lumière dans la section transversale du faisceau, ou profil, qui change avec la distance croissante par rapport au miroir de sortie du laser. La discussion suivante sur les caractéristiques du faisceau laser se veut un exposé général du sujet pouvant s’avérer utile dans l’utilisation de lasers pour l’imagerie microscopique, les pinces laser et d’autres applications.

Lorsqu’un laser fonctionne dans le mode électromagnétique transversal le plus simple, appelé mode TEM(00), le faisceau émis présente un front d’onde planaire et un profil d’intensité gaussien (irradiance). Le diamètre du faisceau laser est généralement défini comme la valeur à laquelle l’intensité est tombée à e(E-2) (13,5 %) de sa valeur de crête. Le profil gaussien du faisceau laser s’explique par la diffraction, qui empêche la propagation d’un faisceau parfaitement collimaté et induit une propagation transversale des ondes lumineuses. Près de l’ouverture de sortie du laser (appelée champ proche), les fronts de phase du faisceau peuvent être désorganisés. Par conséquent, la forme de la section tranversale, la taille et le profil d’irradiance du faisceau changent rapidement en fonction de la distance par rapport au laser. À de plus grandes distances (le champ lointain), les fronts de phase se stabilisent pour donner le profil gaussien résultant. Dans certaines références bibliographiques, le champ proche et le champ lointain sont désignés, respectivement, par les termes alternatifs de zone de Fresnel et de zone de Fraunhofer. Le champ proche est aussi parfois appelé la portée de Rayleigh. Le champ lointain commence à une distance z définie par la formule

z = A⁰₂/λ

où A(0) est le diamètre du faisceau à l’ouverture de sortie et λ est la longueur d’onde de la lumière émise par le laser. En appliquant cette équation à un laser à argon émettant un faisceau de 0,6 millimètre de diamètre au niveau de la taille à une longueur d’onde de 488 nanomètres, le champ lointain commence à environ 74 centimètres de l’ouverture de sortie.

La figure 2 est une représentation schématique de la géométrie et de la divergence du faisceau laser dans les champs proche et lointain. Comme nous l’avons vu plus haut, le faisceau peut être considéré essentiellement comme un faisceau parallèle de fronts d’onde qui subit peu de diffusion dans le champ proche. Au-delà du champ proche, l’angle de divergence du faisceau (θ), mesuré du centre du faisceau jusqu’au bord (e(E-2)), augmente et devient le paramètre critique pour déterminer le diamètre du faisceau (D) selon l’équation :

Diamètre du faisceau (D) = 2L • tan(θ)

où D est le diamètre du faisceau laser et L représente la distance entre l’ouverture de sortie du laser et le point de mesure sur le faisceau. Dans la pratique, plusieurs caractéristiques du faisceau laser, y compris le profil d’irradiance, constituent des facteurs critiques dans de nombreuses applications de microscopie, et la connaissance de la distance jusqu’au champ lointain peut être nécessaire pour configurer le système d’imagerie. Le tableau 1 présente les valeurs calculées de cette distance (calculées au moyen de l’équation indiquée plus haut) pour un certain nombre de lasers et de raies d’émission couramment utilisés et de diamètres de la taille du faisceau typiques.

Distance jusqu’au champ lointain

Tableau 1

Dans la plupart des applications laser, que le faisceau présente ou non un caractère gaussien va avoir une importance, car le faisceau doit souvent être focalisé, mis en forme ou autrement modifié par des lentilles et d’autres composants optiques. Un faisceau gaussien possède certaines caractéristiques de transformation définissables, ce qui permet de présumer la façon dont le faisceau va se propager dans un système optique.

Le rayon angulaire (ou angle de divergence du faisceau ; voir la figure 2), désigné par θ (en radians), d’un faisceau gaussien dans le champ éloigné est calculé de façon approchée par l’expression :

θ = λ /πa₀

où a(0) est le rayon de la taille du faisceau au niveau de l’ouverture de sortie du laser. Le diamètre de la taille du faisceau est fonction de la longueur d’onde du laser, de la longueur de la cavité et d’autres paramètres techniques de la cavité. À mesure que la distance (z) à partir du laser augmente, le rayon de la taille du faisceau est donné par l’équation :

a(z) = θ_z

En général, les faisceaux laser sont caractérisés par des paramètres de propagation de faisceau tels que le carré de M, ou K (qui équivaut à l’inverse du carré de M), déterminés à partir d’une combinaison de mesures de champ proche et de champ lointain comme suit :

M²= πA₀θ/4λ

Des valeurs plus petites de M2, appelées constante de propagation ou facteur de propagation, indiquent une meilleure qualité du faisceau, avec notamment un diamètre et une divergence plus faibles. Le facteur décrit la relation entre le faisceau réel et un faisceau gaussien idéal.

Les faisceaux gaussiens cohérents ont des propriétés spécifiques qui les différencient des faisceaux lumineux incohérents dans leur propagation et leur transformation par des lentilles et des miroirs. Dans le cas d’un faisceau à diffraction limitée, le profil d’intensité d’un faisceau gaussien est lui-même gaussien, à condition que le faisceau ne soit pas tronqué par l’ouverture de l’objectif. Lorsque le diamètre du faisceau gaussien est égal à la moitié du diamètre d’ouverture de l’objectif, le profil d’intensité du faisceau émergent reste gaussien. Lorsque le diamètre du faisceau gaussien est égal au diamètre de l’ouverture de l’objectif, le profil d’intensité du faisceau de sortie est un mélange de la fonction gaussienne et du profil d’une tache d’Airy. Enfin, un diamètre de faisceau gaussien significativement plus grand que le diamètre de l’ouverture de l’objectif produit le profil de sortie d’une tache d’Airy. Dans ce dernier cas, une grande partie de la puissance du laser peut être perdue en raison d’un remplissage excessif de l’ouverture d’entrée de l’objectif.

Le sujet général de l’optique à faisceau gaussien est traité en détail dans de nombreux manuels, et les détails non abordés ici pourront être obtenus de sources plus complètes. Deux types de manipulation du faisceau gaussien présentent un intérêt particulier pour le microscopiste recourant aux lasers : la concentration du faisceau et l’expansion du faisceau.

Lorsqu’un faisceau laser est focalisé sur un très petit point par un objectif de microscope sans aberration (concentration du faisceau), le rayon de ce point au foyer (à la distance z) est donné par les expressions suivantes :

a(z) = λf/πa₀

où f est la longueur focale de l’objectif. Par exemple, si un objectif 100X avec une ouverture numérique de 1,3 (produisant une longueur focale d’environ 1,6 millimètre) est utilisé pour concentrer le faisceau de 488 nanomètres d’un laser à argon ayant un rayon de 0,3 millimètre, le rayon du point de focalisation (déterminé à partir de l’équation précédente) est de 0,8 micromètre. L’augmentation par cinq de la taille du faisceau au moyen de l’expansion du faisceau (abordé ci-après) entraînerait un rayon de point de focalisation d’environ 0,16 micromètre.

Il est important de noter que des densités de puissance extrêmement élevées sont obtenues au point focal d’un faisceau laser concentré. Un faisceau de 10 mW focalisé sur un point à diffraction limitée de 0,22 micromètre de diamètre donne une densité de puissance d’environ 30 MW/cm². De tels niveaux d’énergie peuvent rapidement dégrader ou détruire les revêtements des lentilles et des filtres et produire des dommages photochimiques considérables aux échantillons biologiques. Toutefois, pour une taille de point si infime, un faisceau proche infrarouge à haute énergie ne causera que des dommages assez limités à un échantillon biologique compte tenu du peu d’efficacité de la diffusion de l’énergie thermique dans l’eau, sauf si l’absorption d’énergie par l’échantillon est suffisamment élevée.

Dans de nombreux cas d’utilisation des lasers en microscopie optique, le faisceau laser est initialement dilaté au moyen d’un dilatateur de faisceau keplérien ou galiléen, qui sont en réalité des télescopes inversés (les caractéristiques structurales typiques d’un dilatateur de faisceau laser sont représentées à la figure 3). La divergence d’un faisceau gaussien cohérent peut être réduite, et le faisceau collimaté de manière optimale sur une plus longue distance, si le faisceau laser est d’abord dilaté. Dans les équations précédentes, le rayon angulaire du faisceau, appelé θ, est inversement proportionnel au rayon de la taille du faisceau, a(0), au niveau de l’ouverture de sortie du laser. Par conséquent, la dilatation du rayon de la taille du faisceau réduit la divergence de façon proportionnelle.

Il est pratique pour de nombreuses applications en microscopie de diriger le faisceau du laser directement dans le trajet optique du microscope en le faisant passer dans une fibre optique flexible (comme représenté à la figure 4). Cette technique est préférable à l’autre méthode qui consiste en l’alignement rigide du laser et du microscope, et qui nécessite l’utilisation d’une lourde table optique sans vibrations, de nombreux miroirs fixes et d’autres composants.

Lorsqu’un faisceau laser est focalisé par une lentille sur une fibre optique, l’efficacité de couplage et les caractéristiques du faisceau qui sort de la fibre dépendent fortement de la géométrie de la fibre. La plupart des fibres optiques utilisées pour la diffusion de la lumière laser sont fabriquées avec une âme en silice fondue. Ces fibres se composent d’une âme interne en silice à indice de réfraction élevé entourée d’une gaine composée d’un matériau à indice de réfraction plus faible. La lumière est incapable de s’échapper de la fibre sur toute sa longueur en raison de la réflexion interne totale au niveau de l’interface de l’âme et de la gaine. La gaine peut être en silice, en verre, en fluoropolymère rigide ou en silicone souple.

Les fibres optiques sont classées en fibre monomode ou multimode selon le diamètre de leurs âmes. Une fibre monomode permet de propager un seul mode de propagation à une longueur d’onde donnée (figure 4). La longueur d’onde propagée et la préservation de la polarisation de l’onde sont déterminées par le diamètre de la fibre. D’autres longueurs d’onde peuvent se propager, mais elles se propagent avec une efficacité réduite. Les diamètres typiques des fibres monomodes varient de 3 à 6 micromètres pour les longueurs d’onde de lumière visible, et le profil d’irradiance de sortie d’une fibre monomode est gaussien.

Une fibre optique multimode permet la propagation de plusieurs modes et n’est pas limitée à une seule longueur d’onde. Le diamètre des âmes des fibres optiques multimodes est plus grand que celui des âmes des fibres monomodes, allant d’environ 100 micromètres à 1,2 millimètre de diamètre. Le profil d’irradiance de sortie d’une fibre multimode a une forme plate (profil en haut-de-forme), avec une ouverture numérique déterminée par les indices de réfraction de l’âme et de la gaine.

L’angle du cône d’acceptation, θ, de l’âme de la fibre est lié à l’ouverture numérique (ON) de la fibre comme suit :

ON = sin θ/(n²âme - n²gaine)^1/2

où « n » représente l’indice de réfraction. Un couplage efficace de la lumière laser à l’âme de la fibre se produit lorsque l’ouverture numérique de l’âme de la fibre et celle de la lentille de concentration du faisceau sont égales. L’efficacité de la transmission de la lumière par une fibre optique est généralement élevée, jusqu’à 90 % environ, mais peut être fortement réduite (à seulement 60 ou 70 %) par des courbes de très petits rayons (moins de 3 centimètres).

Lors de l’utilisation d’un laser quel qu’il soit, il est primordial non seulement d’empêcher toute lumière laser directe ou réfléchie d’entrer dans les yeux d’un observateur, mais également d’éviter que le faisceau ne soit réfléchi sur un composant du système optique et renvoyé dans le système de laser. La première précaution est une précaution de sécurité évidente pour l’utilisateur, tandis que la deuxième précaution est importante pour empêcher un réflecteur supplémentaire de renvoyer un faisceau cohérent dans le laser, ce qui pourrait endommager le système.

La stabilité de la source de lumière laser est un aspect important dans de nombreuses applications, en particulier en microscopie quantitative, où les fluctuations d’intensité de l’éclairage peuvent nuire aux résultats expérimentaux. Un certain nombre de facteurs liés aux fluctuations d’émission stimulée et de longueur de cavité peuvent induire un bruit de fréquence dans le faisceau produit, mais d’autres perturbations entraînant des fluctuations d’amplitude peuvent créer à la fois un bruit de fluctuation d’intensité à haute fréquence et de lentes variations (dérive) de la puissance optique produite. Certaines sources de ces fluctuations d’intensité sont liées au fonctionnement de la tête laser elle-même ou à l’alimentation électrique. Les sources de bruit les plus courantes dans le faisceau produit pour différentes catégories de laser sont répertoriées ci-dessous :

• Lasers à gaz – Parmi les sources potentielles de bruit, on peut citer : mauvais alignements des miroirs causés par les vibrations du résonateur, bruit causé par les sources de pompage optique, oscillations du plasma et instabilités du processus de décharge ionique, fluctuations du courant d’alimentation électrique, effet microphonique causé par la turbulence de l’eau de refroidissement ou encore bruit induit par le ventilateur dans les systèmes de refroidissement à air forcé.
• Lasers à solide – Les sources de bruit sont les suivantes : effet microphonique, fluctuations de source de pompage pour les pompes à lampe et à diode, erreurs d’alignement de la cavité et bruit aléatoire lié à la fréquence (appelé bruit 1/f), qui est lié aux fluctuations thermiques dans le milieu laser.
• Lasers à colorant – Le bruit (haute fréquence) et la dérive sont dus à la non-homogénéité de la densité et aux bulles d’air dans la solution de colorant, ainsi qu’aux instabilités de la source de pompage du colorant et de la source de pompage du laser.
• Lasers à semi-conducteurs (diodes) – Le bruit peut résulter de fluctuations du courant d’entraînement (biais) ou de la température, et le bruit 1/f est causé par le piégeage des porteurs de charge dans la jonction et par d’autres types d’effets de recombinaison des porteurs de charge (électron-trou).

Tous les lasers sont sensibles au bruit introduit par leurs alimentations électriques. Les alimentations à découpage, devenues courantes en raison de leur efficacité et de leur petite taille, sont particulièrement susceptibles d’introduire des ondulations dans le système de laser à des fréquences allant jusqu’à des dizaines de kilohertz. De telles interférences, lorsqu’elles affectent le faisceau lumineux dans les systèmes de microscopie optique, peuvent être particulièrement difficiles à diagnostiquer et à éliminer. La principale difficulté est due à leur similitude avec le bruit introduit dans le système par d’autres sources, comme les champs électromagnétiques dans les environnements de laboratoire. Pour obtenir une stabilité adéquate du faisceau, les lasers à semi-conducteurs doivent être utilisés avec des alimentations de courant à diodes ayant la plus grande stabilité électrique et le plus faible bruit disponibles, et avec un contrôle précis de la température. Les autres sources de bruit externes doivent être contrôlées, notamment la poussière du laboratoire et les vibrations provenant de la circulation locale et des équipements de construction.

L’intensité du faisceau des lasers à onde continue (cw) peut être stabilisée en contrôlant électroniquement le courant du tube ou en utilisant des composants externes qui modulent l’intensité lumineuse. Deux méthodes différentes sont souvent utilisées pour contrôler le courant d’entraînement du tube. En mode courant constant, le courant du tube est directement contrôlé par une boucle de rétroaction électronique afin de minimiser les fluctuations. Comme le faisceau laser produit dépend également de la température, ce type de circuit de contrôle est particulièrement efficace si un contrôle adéquat de la température est assuré. Les systèmes de stabilisation de la puissance de sortie constante fonctionnent en contrôlant le courant d’entraînement en réponse à un signal provenant d’un circuit qui échantillonne le faisceau produit à l’aide d’un diviseur de faisceau et d’un moniteur à photodiodes. Cette agencement physique est applicable aux lasers à gaz et à plusieurs autres géométries, mais les petits lasers à diodes sont généralement assemblés dans un boîtier qui inclut déjà une photodiode intégrée. La photodiode du moniteur échantillonne les émissions provenant de la facette arrière du wafer du laser et produit un signal qui permet le contrôle par rétroaction de la puissance de sortie.

Les composants externes utilisés pour stabiliser l’intensité du laser utilisent généralement un système de rétroaction rapide pour contrôler un modulateur électro-optique qui minimise les fluctuations de la puissance du faisceau. Le modulateur à cellule de Pockels externe (voir la figure 5) est proposé par plusieurs fabricants et peut être utilisé, en principe, pour stabiliser la puissance de sortie de tout laser à onde continue. De grandes fluctuations d’intensité (jusqu’à environ 50 %) peuvent être corrigées par cette technique, mais avec une réduction proportionnelle de la puissance de sortie totale. Un large éventail de capacités de correction est important avec de nombreux systèmes. Le laser hélium-cadmium, par exemple, peut présenter une variation de la puissance de sortie d’environ 20 % en partie due à une forte oscillation du plasma entre certaines fréquences de faisceau. Il existe des systèmes qui sont signalés comme étant adaptés à la régulation des lasers cw et à modes synchronisés à un niveau de l’ordre de quelques centièmes de pourcentage de leur puissance de sortie et sur une plage de fréquence allant du courant continu à plusieurs centaines de mégahertz, avec une atténuation du bruit de 500:1, voire plus.

Les composants de base d’un modulateur à cellule de Pockels sont représentés à la figure 5. Les dispositifs externes de régulation de l’intensité du faisceau laser, semblables à la conception illustrée à la figure 5, sont parfois classés ou commercialisés sous le terme anglais noise eaters (mangeurs de bruit). Le concept fondamental des modulateurs électro-optiques utilisant l’effet Pockels repose sur un mécanisme permettant de varier les propriétés de polarisation de la cellule à une vitesse extrêmement rapide pour fournir un atténuateur de faisceau variable permettant de contrôler l’intensité du laser. L’état de polarisation du rayonnement laser détermine l’atténuation totale du modulateur, mais une transmission jusqu’à 80 % est possible. À la suite de l’émission de la tête du laser, une partie du faisceau est déviée par un diviseur de faisceau vers une photodiode, qui compare l’intensité à une intensité de référence prédéfinie (sélectionnable), et amplifie le signal de la différence pour qu’il puisse piloter le modulateur à cellule de Pockels électro-optique. Le signal amplifié produit un changement d’indice de réfraction dans la cellule qui fait pivoter le plan de polarisation, faisant ainsi varier l’atténuation du faisceau proportionnellement à la différence de tension appliquée. Parmi les substances qui présentent un changement de propriétés de polarisation induits par des changements de champ électrique (effet Pockels), on peut citer le dihydrogénophosphate de potassium et le niobate de lithium, et les cristaux de ces composés sont couramment utilisés dans les modulateurs de faisceau.

Dans les situations où de la lumière polarisée de façon aléatoire est stabilisée par un système à cellules de Pockels, le modulateur doit être placé entre les polariseurs croisés, et il est nécessaire de prendre en considération les effets de ces composants supplémentaires sur la stabilité du faisceau. Étant donné que la poussière, les vibrations et d’autres interférences peuvent altérer la stabilité du faisceau à n’importe quel point du trajet optique, il est important que des stabilisateurs externes soient placés le plus près possible de la position de l’échantillon dans les systèmes de microscopie optique. Cette précaution permet de garantir une plus grande stabilité du faisceau délivré à l’échantillon.

Les lasers à diode, des dispositifs à semi-conducteurs en développement depuis des décennies, sont maintenant proposés avec une puissance de sortie suffisante pour intéresser les microscopistes. Les lasers à diode sont disponibles dans une plage de longueurs d’onde allant de l’ultraviolet au proche infrarouge, avec une puissance de sortie suffisamment importante pour les applications de microscopie confocale. En outre, ces lasers à diode présentent une forme et une stabilité de faisceau améliorées, ce qui leur a permis de remplacer les lasers à gaz dans pratiquement toutes les applications. Les lasers à diode ont généralement une durée de vie comprise entre 10 000 et 50 000 heures, mais sont extrêmement sensibles aux chocs électrostatiques. Ils doivent donc être manipulés avec précaution.

Le développement de lasers à diode accordables, qui peuvent rivaliser en matière de puissance et de polyvalence avec les lasers à colorant et les lasers titane-saphir accordables, présente un grand intérêt pour les microscopistes optiques (comme il est expliqué ci-après et illustré à la figure 1). Les lasers à colorant accordables ont une plage de longueurs d’onde de 600 à 1 800 nanomètres et peuvent fournir une puissance de 5 à 25 mW. Ils présentent les avantages d’un coût relativement faible, d’une taille compacte, d’une longue durée de vie et d’une production de chaleur réduite, éliminant ainsi la nécessité d’avoir des systèmes de refroidissement externes.

Les lasers à solide à diodes de pompage (DPSS) utilisent un laser à diode au lieu de gaz nobles, de lampes à arc ou de lampes flash pour pomper le matériau actif solide. La puissance de sortie, la qualité du faisceau et la stabilité des lasers à diodes de pompage s’approchent de celle d’un laser à gaz (hélium-néon), mais l’efficacité et la taille sont davantage comparables à celle des lasers à diode. Les coûts d’exploitation et de maintenance typiques des lasers à diodes de pompage sont inférieurs à ceux des lasers à gaz, et la plupart des systèmes sont refroidis par convection ou par air pulsé.

Les lasers à grenat d’yttrium-aluminium dopé au néodyme (Nd:YAG) pompés à diodes de pompage produisent une lumière de 1064 nanomètres dans la plage de puissance des milliwatts. Le doublement de la fréquence permet d’obtenir un dispositif compact, avec un faisceau à onde continue à 532 nanomètres, et le triplement de la fréquence peut également être utilisé pour générer un faisceau pulsé à 355 nanomètres. Le résonateur étroitement replié (TFR) a été développé pour pomper un cristal de fluorure de lithium yttrium dopé au néodyme (Nd:YLF) avec une puissance et une efficacité élevées au moyen d’un réseau de lasers à diodes pour générer plusieurs watts de puissance à 1 047 nanomètres. Le doublement, le triplement et le quadruplement de la fréquence dans ce type de laser donne des puissances de sortie allant jusqu’à plusieurs centaines de milliwatts de lumière cohérente à 523, 349 et 262 nanomètres (deuxième, troisième et quatrième harmoniques). Les autres avantages des lasers à diode comme sources de pompage sont les suivants : une durée de vie prolongée (généralement plus de 5 000 heures, contre seulement quelques centaines d’heures pour les lampes), un faisceau collimaté et facile à focalisé, qui équivaut au petit volume d’action laser du laser à solide, et une charge thermique considérablement réduite du barreau laser, qui nécessite généralement un refroidissement à l’eau lorsque des lampes à arc halogènes sont utilisées comme pompes.

Le développement de lasers à solide à diode de pompage s’est fait sous l’impulsion d’applications industrielles et commerciales nécessitant une puissance élevée (généralement plusieurs watts) dans les plages de longueurs d’onde du vert (532 ou 523 nanomètres) et de l’ultraviolet (355 ou 349 nanomètres et le quatrième harmonique à 266 nanomètres). Le faisceau produit dans la région spectrale de l’ultraviolet est pulsé, avec des énergies allant de 100 microjoules à 10 millijoules, des durées d’impulsion de l’ordre de la nanoseconde et des fréquences de récurrence des impulsions allant jusqu’à 10 kHz. Ces lasers sont très utiles en microscopie pour déclencher la libération de composés captifs. Toutefois, les fréquences de récurrence des impulsions sont encore trop faibles pour une utilisation comme source d’éclairage dans la plupart des applications de microscopie confocale.

D’autres évolutions ont conduit à la combinaison de lasers à solide à diodes de pompage avec des oscillateursparamétriques optiques (OPOS ; voir la figure 8) pour produire un faisceau pulsé accordable continuellement variable de 205 à 2 000 nanomètres. Les systèmes proposés initialement étaient coûteux et de fonctionnement complexe, mais des versions plus adaptées à une utilisation en microscopie ont été introduites.

Les lasers saphir dopés au titane (communément connus sous le nom de lasers Ti:Saphir, voir la figure 1) offrent l’avantage d’être accordables en ce qui concerne la production de lumière pulsée et continue ainsi que la grande fiabilité des lasers à solide. Ces lasers peuvent délivrer des impulsions lumineuses très courtes (environ 80 à 100 femtosecondes) à des fréquences de récurrence élevées (100 MHz). La plage des longueurs d’onde accordables s’étend des régions spectrales du rouge lointain aux proches infrarouges (700 à 1000 nanomètres). La plupart de ces lasers fonctionnent avec un pompage optique réalisé par des lasers à argon très puissants et nécessitent un refroidissement par eau. En raison des coûts et de la complexité liés à l’utilisation et à la maintenance des lasers Ti:Saphir, leur utilisation s’est principalement limitée à la microscopie multiphotonique.

Conclusions

L’une des différences majeures entre les microscopies de fluorescence laser multiphotonique et confocale est le type de laser utilisé dans ces techniques souvent complémentaires. Les lasers utilisés pour la microscopie multiphotonique sont beaucoup plus coûteux et difficiles à utiliser que les petits lasers refroidis à l’air utilisés en microscopie confocale.

De nos jours, les applications des lasers se développent rapidement dans les domaines de la microscopie confocale, des pinces optiques et de la libération de fluorophores et de composés captifs. Le développement de lasers à solide compacts avec des raies d’émission couvrant le spectre complet devrait permettre d’accroître davantage l’utilisation de ces systèmes dans le domaine de la microscopie.