Introduction aux microscopes à balayage laser
Les microscopes à balayage laser utilisent un éclairage laser pour générer des images 3D à haute résolution et à contraste élevé en balayant les échantillons point par point. Les deux types les plus courants de microscopes à balayage laser sont les microscopes à balayage laser confocaux et les microscopes à balayage laser multiphotoniques. Bien que tous deux utilisent des lasers pour exciter l’échantillon, ils se distinguent par quelques différences importantes. Nous expliquerons dans cet article comment fonctionnent les microscopes à balayage laser confocaux et multiphotoniques, quelles sont leurs utilisations et quels types d’images ils peuvent créer.
Microscopes à balayage laser confocaux |
Microscopes à balayage laser multiphotoniques |
Principe des microscopes à balayage laser confocaux
Les microscopes à balayage laser de type confocal utilisent un laser à onde continue de faible longueur d’onde pour créer une lumière d’excitation de haute intensité qui va éclairer l’échantillon. Ce laser est réfléchi par un miroir dichroïque, puis par deux autres miroirs qui, chacun leur tour, vont diriger le laser pour qu’il balaye un échantillon marqué par un fluorophore. Lorsqu’il est excité par le laser, le fluorophore présent dans l’échantillon devient fluorescent et émet une lumière de longue longueur d’onde qui est renvoyée par les miroirs précédemment utilisés pour diriger la lumière d’excitation. La lumière émise traverse ensuite le miroir dichroïque, où elle est focalisée sur un sténopé puis recueillie et mesurée par le détecteur. Le détecteur est relié à un ordinateur qui crée une image numérique 3D point par point. Comme le sténopé bloque toute fluorescence en dehors du plan focal, l’image créée est très détaillée. Le principe de la microscopie confocale à balayage laser consiste à focaliser le laser et le détecteur sur le même point de l’échantillon et à déplacer ce point de focalisation pour finalement former une image complète de l’échantillon. |
Principe des microscopes à balayage laser multiphotoniques
Les microscopes à balayage laser de type multiphotonique fonctionnent de manière très similaire aux microscopes à balayage laser confocaux. Cependant, alors que les microscopes à balayage laser confocaux utilisent un laser à courte longueur d’onde dans le visible pour exciter l’échantillon, la microscopie à balayage laser multiphotonique utilise quant à elle un laser femtoseconde à impulsions infrarouges (IR) émises à des longueurs d’onde deux fois plus longues que ce qui est nécessaire pour l’excitation d’un seul photon. Lorsque le fluorophore présent dans l’échantillon absorbe deux photons simultanément, il peut émettre de la fluorescence. Ce phénomène d’absorption de deux photons se produit uniquement à la position de focalisation où la densité des photons est fortement concentrée, et seul le fluorophore situé au point focal peut être excité et émettre de la fluorescence. Par conséquent, un système de microscope à balayage laser multiphotonique n’a pas besoin d’une ouverture à sténopé pour bloquer la fluorescence en dehors du point focal pour son détecteur NDD, et la fluorescence du point focal peut être détectée efficacement. L’intérêt de cette méthode d’excitation alternative est que le laser à longueur d’onde plus longue peut pénétrer plus profondément dans les tissus, ce qui permet d’observer et de prendre des images sur plusieurs centaines de micromètres de profondeur dans le volume de tissu vivant. De plus, la phototoxicité est réduite par rapport aux lasers visibles à longueur d’onde courte. Les microscopes à balayage laser multiphotoniques sont donc plus adaptés à l’étude in vivo des cellules et des tissus vivants.
Utilisations des microscopes à balayage laser
Bien que très utiles dans un large éventail de domaines, les microscopes à balayage laser confocaux sont le plus souvent utilisés pour la recherche en biologie. Ils sont souvent utilisés pour la recherche en biologie cellulaire, la recherche sur le cancer et la recherche sur les cellules souches, en raison de leur capacité à créer des images 3D de cellules très détaillées permettant d’examiner l’intérieur de l’échantillon analysé. En effet, les microscopes à balayage laser confocaux peuvent sectionner optiquement la lumière pour produire des images à haute résolution d’échantillons de tissus épais sans avoir à sectionner physiquement l’échantillon. En raison de la pénétration profonde de leur laser femtoseconde à impulsions IR, les microscopes à balayage laser multiphotoniques sont plus adaptés pour l’imagerie in vivo sur des animaux vivants. C’est pourquoi ils sont souvent choisis pour la recherche en neurosciences et la recherche sur le cancer.
Avantages et inconvénients des microscopes à balayage laser
Les microscopes à balayage laser jouent un rôle indispensable dans l’étude des cellules et des tissus biologiques, en grande partie grâce à leur capacité à balayer les échantillons point par point. Les autres avantages du microscope à balayage laser confocal incluent sa capacité à créer des images 3D des cellules et des tissus en haute résolution et à contraste élevé, sans avoir à sectionner physiquement l’échantillon.
La raison pour laquelle les microscopes à balayage laser peuvent produire des images de qualité supérieure s’explique par leur grande efficacité pour rejeter la lumière fluorescente hors plan focal par le sténopé confocal, de sorte qu’un seul point focal à la fois est recueilli par le détecteur.
Pour cette même raison, l’assemblage d’une image 3D complète d’un échantillon peut prendre beaucoup de temps. Cependant, les progrès réalisés dans les équipements disponibles accélèrent le processus. Par rapport au balayage galvanométrique classique, le balayage par résonance peut produire des images à plus grande vitesse, atteignant jusqu’à 30 images par seconde, pour observer des événements dynamiques rapides comme la circulation sanguine ou le flux d’ions dans les cellules.
Comparaison du balayage laser et du disque rotatif
L’introduction d’un disque rotatif est un bon exemple de progrès technologique qui a accéléré la capacité de collecte point par point des microscopes à balayage laser. La microscopie confocale à disque rotatif se distingue par le nombre de sténopés utilisés pour bloquer la lumière fluorescente hors plan focal. Alors que la microscopie à balayage laser confocale classique utilise un seul sténopé, la microscopie confocale à disque rotatif utilise un disque opaque percé de centaines de sténopés qui tourne à grande vitesse. Cela permet d’acquérir une image de l’échantillon entier en une fois plutôt que point par point. Cela peut également permettre de réduire les photodommages et le photoblanchiment.
Les images des microscopes à balayage laser
Comme nous l’avons indiqué précédemment, la haute résolution et le contraste élevé des images d’un microscope confocal à balayage laser s’expliquent par la suppression par le sténopé de toute lumière fluorescente en dehors du plan focal avant qu’elle n’atteigne le détecteur. Après la création de l’image 3D, il est possible manipuler, voire explorer l’intérieur de l’image dans certains cas.
Comparaison de la microscopie à balayage laser et de la microscopie électronique à balayage
Bien que leurs noms se ressemblent, la principale différence entre le microscope à balayage laser et le microscope électronique à balayage repose sur la méthode d’éclairage de l’échantillon. Alors que la microscopie à balayage laser utilise un ou plusieurs lasers d’excitation, la microscopie électronique à balayage, comme son nom l’indique, irradie l’échantillon avec un faisceau d’électrons. Les électrons réfléchis ou les électrons secondaires provenant de la surface de l’échantillon produisent des signaux révélateurs de sa topographie ou de sa composition, lesquels sont recueillis par le détecteur. Comme l’échantillon doit être placé sous vide, la microscopie électronique à balayage ne peut pas être utilisée pour l’observation d’échantillons vivants.
Le grossissement des microscopes à balayage laser
Les microscopes à balayage laser peuvent être utilisés avec divers objectifs de grossissement. Par conséquent, le grossissement maximal d’un microscope à balayage laser dépend de l’objectif utilisé. Les objectifs de faible grossissement sont parfaits pour observer la structure d’un échantillon de tissu entier. S’il faut observer la morphologie des cellules qui composent un tissu, un objectif de grossissement moyen suffit normalement. Les objectifs de fort grossissement peuvent être utilisés quant à eux pour visualiser la microstructure des cellules qui composent le tissu.
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