Obtenir des résultats expérimentaux plus rapidement grâce à un processus de culture cellulaire systématique

Le développement et la modernisation des processus de culture cellulaire engendrent une demande croissante en technologies qui permettent la normalisation des procédures, une documentation précise et une réduction des temps d’exécution et des charges de travail. Le présent article technique décrit des solutions permettant de mettre en œuvre des processus de culture cellulaire efficaces et normalisés pour accélérer l’obtention de résultats dans le cadre d’applications fondées sur la culture cellulaire.

Une demande croissante pour l’amélioration des processus de culture cellulaire

Un processus de culture cellulaire efficace jette les bases nécessaires au succès dans diverses applications des industries pharmaceutique et des sciences de la vie – de la recherche sur les cellules souches et le cancer jusqu’à la médecine régénérative. La capacité d’observer et de documenter avec précision les cellules à mesure qu’elles se développent, prolifèrent et se différencient in vitro est essentielle pour garantir la qualité et la reproductibilité tout au long du processus de culture cellulaire. Par conséquent, de nombreux laboratoires adoptent des technologies qui permettent la normalisation des procédures et une documentation précise des cultures tout en améliorant la vitesse et l’efficacité.

Améliorer l’efficacité, la normalisation et la documentation dans le domaine de la culture cellulaire

Dans sa forme la plus élémentaire, le processus de culture cellulaire implique de quantifier la prolifération et la densité (ou confluence) des cellules tout en évaluant leur morphologie. L’adoption d’un processus de culture cellulaire qui rend ces tâches plus efficaces, précises et normalisées contribue à améliorer la reproductibilité des expériences en aval :

• La normalisation des conditions de culture assure que les échantillons sont comparables d’un chercheur à l’autre ou d’une expérience à l’autre. Les cellules cultivées dans des conditions incohérentes peuvent présenter des profils de croissance et une expression génique altérés, ce qui a un impact sur la fonction des cellules.
• La documentation des résultats procure un tableau précis du comportement des cellules au fil du temps et apporte une traçabilité pour de futures références, vérifications, demandes de brevet ou questions en vue d’une publication.
• Un processus exécuté avec rapidité et efficacité préserve la viabilité des cellules en culture en réduisant au minimum le temps pendant lequel les cellules sont en dehors des conditions d’incubation optimales. Il permet également aux scientifiques d’avoir plus de temps à consacrer à d’autres tâches.

Le processus de culture cellulaire moderne peut tirer parti des améliorations apportées aux systèmes de culture cellulaire classiques, comme le microscope inversé, tout en incorporant des avancées technologiques qui contribuent à l’automatisation du laboratoire de culture cellulaire (figure 1).

Figure 1. Technologies qui permettent l’optimisation des processus de culture cellulaire

Caractéristiques matérielles qui améliorent les microscopes pour culture cellulaire

Le succès en culture cellulaire repose sur une observation informative et un processus efficace. Au fur et à mesure de l’évolution de la microscopie, diverses caractéristiques matérielles ont été intégrées aux systèmes conçus pour l’observation et l’analyse des cultures cellulaires pour résoudre différents problèmes rencontrés lors de la manipulation des cultures cellulaires (figure 2).

Figure 2. Le microscope pour culture cellulaire CKX53 (à gauche) et le système de surveillance de l’incubation Olympus Provi™ CM20 (à droite) offrent
des fonctionnalités qui permettent de simplifier la normalisation et le contrôle de la qualité dans les processus de culture cellulaire.

Par exemple, des caractéristiques ergonomiques, comme la conception permettant le positionnement naturel de la main pour la mise au point et l’échantillonnage, augmentent la vitesse de manipulation des cellules et réduisent ainsi le temps qu’elles passent en dehors des conditions d’incubation optimales, ce qui leur est bénéfique. Tout le temps passé en dehors d’un incubateur augmente les risques de contamination et peut stresser les cellules, ce qui peut altérer la physiologie et entraîner des incohérences entre les échantillons.

Ces systèmes présentent également un format compact qui permet de les placer à l’intérieur d’enceintes de sécurité biologique. L’observation peut être effectuée dans un environnement stérile, ce qui réduit les risques de contamination.

Uniformité des observations à contraste élevé des cultures cellulaires

Une autre amélioration apportée au processus de culture cellulaire est la capacité d’effectuer rapidement des observations à contraste élevé. L’association de microscopes pour culture cellulaire à des composants optiques perfectionnés permet de visualiser clairement un grand champ d’observation et de cribler les cellules facilement et rapidement.

Les progrès apportés aux méthodes d’observation améliorent également le processus d’imagerie des cellules en culture. Le contraste de phase est une méthode très appréciée des biologistes cellulaires. Cependant, cette méthode ne fonctionne adéquatement que si l’on prépare et centre chacun des objectifs et qu’on les utilise avec leur anneau de phase approprié. Le tout peut prendre du temps et entraîner des erreurs si les chercheurs désalignent les anneaux de phase ou utilisent des anneaux inappropriés lors des changements de grossissements.

Pour résoudre ce problème, Evident propose la technologie de contraste de phase intégré (iPC), qui fournit une image à contraste élevé sans qu’il soit nécessaire de changer le diaphragme d’ouverture annulaire lors du passage d’un objectif 4X à un objectif 40X. Ce processus plus simple améliore l’efficacité et élimine les risques de manque d’uniformité entre les chercheurs.

Une grande polyvalence pour un large éventail de tâches d’observation et d’analyse

Les fonctionnalités d’imagerie de fluorescence augmentent la polyvalence des microscopes pour culture cellulaire et permettent ainsi aux chercheurs d’effectuer des observations de routine et des études fonctionnelles sur un même système. Il y a donc économie d’espace et réduction des coûts. Un seul système peut être utilisé pour plusieurs étapes du processus de culture cellulaire, que ce soit pour le contrôle de l’ensemencement, la prolifération, le repiquage ou l’imagerie par fluorescence à contraste élevé aux fins de l’analyse des cellules au moyen d’une vaste gamme de flurophores.

Une acquisition d’images simple et flexible

Une partie importante du processus de culture cellulaire est la documentation de routine des cellules au moyen d’images. De nombreux microscopes inversés pour culture tissulaire peuvent accueillir diverses caméras numériques afin que le chercheur puisse prendre des images pendant qu’il travaille.

Jusqu’à récemment, ces caméras devaient être connectées à un ordinateur d’imagerie. Un ordinateur peut occuper un espace précieux sur la paillasse dans une salle de culture tissulaire, et en raison de la connexion filaire entre la caméra et l’ordinateur, les appareils devaient être placés l’un à côté de l’autre, ce qui limitait les options de positionnement de ceux-ci. Les systèmes de caméras modernes règlent ces problèmes grâce à des options d’imagerie flexibles et peu encombrantes. Par exemple, la caméra EP50 d’Olympus peut se connecter sans fil à une variété d’appareils différents : un ordinateur, une tablette ou un téléphone mobile multifonction. Cette configuration sans fil permet également de déplacer le microscope dans l’espace de culture tissulaire et de le placer à des endroits pratiques.

De plus, on a intégré directement dans la caméra EP50 un système d’exploitation, un logiciel et des options de stockage, ce qui apporte une flexibilité accrue. Il est donc possible de monter un moniteur directement sur la caméra pour créer une solution d’imagerie tout-en-un. Cette configuration élimine complètement le besoin d’utiliser un ordinateur externe. L’unité entière peut également être utilisée en toute sécurité à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique et prendre des images dans un environnement stérile.

Figure 3. Microscope pour culture cellulaire CKX53 et caméra EP50

Générer des données quantifiables sur la croissance cellulaire

Un élément essentiel à la réussite d’une culture cellulaire est de pouvoir suivre correctement à long terme la croissance et la confluence des cellules. La croissance d’une culture cellulaire passe par trois phases distinctes : la phase de latence, la phase logarithmique et la phase de plateau (figure 4).

Figure 4. Croissance cellulaire

La prolifération cellulaire commence dans la phase de latence, laquelle est suivie d’une phase logarithmique exponentielle à mesure que la concentration en facteur de croissance augmente. Lorsque les nutriments sont complètement consommés ou que la densité cellulaire augmente, une inhibition de contact se produit et la prolifération cellulaire stagne. Il est essentiel de choisir le bon moment pour récolter les cellules en prolifération, car on s’assure ainsi qu’elles se sont suffisamment multipliées pour assurer un rendement suffisant, mais qu’elles n’ont pas encore atteint la saturation.

Que les échantillons de cellules soient préparés pour le repiquage, l’expérimentation en aval ou le stockage, une numération cellulaire précise est essentielle pour les raisons suivantes :

• Repiquage : Des densités de repiquage uniformes assurent que les cellules des différentes cultures prolifèrent à la même vitesse et que leur viabilité est la même.
• Expérimentation en aval : Des numérations de cellules identiques facilitent l’obtention de résultats comparables.
• Stockage : Il est important de connaître la concentration et la viabilité des cellules dans chaque fiole pour réactiver une lignée cellulaire ayant été stockée.

Les estimations de la confluence des cellules et de leur nombre sont souvent faites visuellement : elles sont donc très variables. Si vous placez une même plaque de cellules devant plusieurs chercheurs, il est probable que vous obteniez une grande diversité d’estimations du nombre de cellules et de leur confluence.

Régularité du contrôle des cultures

Même si un microscope classique peut aider à garantir que les cultures sont évaluées de manière uniforme, il est tout aussi important de s’assurer que les cultures sont contrôlées régulièrement. Si les cellules ne sont pas contrôlées aux bons jours ou même aux bonnes heures de la journée, on peut manquer le moment optimal pour le repiquage ou toute autre variation expérimentale (figure 5). Un repiquage effectué à un mauvais moment ou à des moments irréguliers peut également causer des problèmes affectant en aval les cultures et les expériences. En combinant un logiciel de culture cellulaire avec un système de surveillance de l’incubation pour assurer un contrôle continu, les chercheurs peuvent savoir exactement quand les cellules sont prêtes pour le repiquage.

Figure 5. La surveillance constante de la croissance cellulaire permet la mise en œuvre d’un processus normalisé.

Analyse automatisée des cellules au moyen de l’intelligence artificielle

Les systèmes de surveillance de l’incubation comme le système CM20 sont équipés d’un logiciel avancé d’intelligence artificielle. L’analyse des cellules effectuée par intelligence artificielle permet d’évaluer automatiquement la viabilité des cellules en culture à l’aide de paramètres constants, ce qui réduit les erreurs humaines et permet la production de lignées cellulaires plus précises et reproductibles.

De plus, ces données et ces paramètres d’analyse peuvent être facilement stockés, réutilisés et transférés. Cela réduit le temps de formation et permet de s’assurer que les différents utilisateurs du laboratoire suivent les mêmes procédures d’évaluation de la viabilité des cellules.

En normalisant votre processus par la collecte de données quantitatives, vous pouvez détecter une culture cellulaire anormale plus tôt et ainsi gagner du temps et réduire au minimum l’utilisation de consommables de laboratoire coûteux sur des cultures cellulaires inexploitables.

Changement de paradigme de la culture cellulaire grâce à la surveillance à distance

Une autre amélioration apportée au processus de culture cellulaire est la surveillance à distance des cultures. Dans un processus de culture cellulaire classique, un chercheur doit être présent pour effectuer manuellement le contrôle de la culture au fil du temps. Les systèmes de surveillance de l’incubation comme le système CM20 peuvent surveiller en continu les plaques de culture cellulaire sans nécessiter l’intervention d’un chercheur. Ces appareils sont placés directement dans l’incubateur de culture cellulaire et fournissent à distance des données quantitatives sur les cultures cellulaires (figure 6).

Figure 6. Le système de surveillance de l’incubation CM20 acquiert dans l’incubateur les données sur les cellules.

Amélioration de la viabilité des cellules

Les systèmes de surveillance de l’incubation sont intrinsèquement efficaces pour maintenir la viabilité des cellules. Comme ces systèmes sont placés directement dans l’incubateur, la surveillance régulière peut se faire sans qu’il soit nécessaire de retirer les plaques de culture de l’incubateur. Les cellules sont donc continuellement maintenues dans des conditions optimales et les risques de contamination sont réduits.

Pendant le processus d’imagerie, les systèmes de surveillance de l’incubation peuvent également utiliser des méthodes d’éclairage conçues spécialement pour maintenir la viabilité des cellules. La surexposition liée aux méthodes d’éclairage en fond clair utilisées avec les microscopes classiques peut endommager les cellules. Pour résoudre ce problème, le système de surveillance de l’incubation CM20 utilise une autre méthode d’éclairage appelée « éclairage épiscopique oblique ». Cette méthode utilise une DEL de 630 nm pour réduire la phototoxicité, même lors d’une observation continue.

La combinaison d’un système de surveillance de l’incubation et d’un logiciel de culture permet également la génération uniforme de données de multiplication cellulaire quantifiables pour la création d’une courbe de multiplication précise, ce qui évite d’avoir à dissocier et à compter les cellules en solution pour optimiser les conditions de culture. Ces systèmes sont conçus pour transmettre des données à distance afin que le chercheur puisse suivre l’évolution de sa culture où qu’il se trouve (figure 7).

Figure 7. Consultez les données de culture cellulaire à distance au moyen du système CM20.

Repenser le processus de culture cellulaire

La culture cellulaire constitue la pierre angulaire des applications des sciences de la vie, et pour obtenir des résultats de grande qualité, il faut avoir un processus de culture cellulaire de grande qualité. Bien que la culture cellulaire soit un domaine déjà bien développé, les nouvelles technologies apportent constamment des améliorations tant incrémentales que décisives pour garantir des résultats uniformes, efficaces et quantifiables.

Les microscopes pour culture cellulaire repensés offrent une ergonomie améliorée, des composants optiques meilleurs et aux performances plus homogènes et la possibilité d’incorporer davantage de modalités d’imagerie, comme la fluorescence.

Les systèmes de surveillance de l’incubation permettent l’acquisition continue de données quantitatives tout en réduisant au minimum les dommages cellulaires et en éliminant une quantité importante de travail manuel de routine.

Ces systèmes fonctionnent mieux lorsqu’ils sont utilisés en complémentarité. Bien que les systèmes de surveillance de l’incubation remplacent l’importante charge de travail associée à la surveillance de routine, à la numération précise des cellules et au repiquage, l’évaluation des cellules fluorescentes est toujours plus efficace lorsqu’un chercheur qualifié les observe au microscope.

En adoptant un nouveau processus qui intègre des technologies de laboratoire intelligentes, les scientifiques peuvent créer un système de culture cellulaire efficace, entièrement documenté et hautement normalisé. En conséquence, les scientifiques peuvent exécuter leurs travaux plus rapidement pour les expériences en sciences de la vie et les applications de médecine régénérative.

Auteurs

Joanna Hawryluk, responsable de produit, Evident
Avi Smith, responsable de produit, Evident