Validation des observations multipoints à l’aide d’un système de surveillance de l’incubation

Introduction

Lors de processus de culture cellulaire de routine, les opérateurs passent énormément de temps et dépensent beaucoup d’énergie pour maintenir de bonnes conditions de culture. Pour gérer correctement les cellules dans le cadre d’un processus de culture cellulaire conventionnel, les opérateurs doivent sortir les cellules de l’incubateur pour pouvoir vérifier leur état au fil du temps en les observant au microscope pour les compter et déterminer leur confluence.

En outre, la qualité des cellules doit être maintenue à un niveau stable tout au long de l’étape de préparation afin d’améliorer la consistance et la reproductibilité des expériences. Toutefois, des différences en matière de qualité d’exécution de ces opérations peuvent survenir en fonction du niveau de compétences de l’opérateur et d’autres facteurs. Étant donné que la culture cellulaire constitue le point de départ de la recherche en sciences de la vie et médicale, la qualité des cellules a un impact considérable sur les expériences ultérieures. Par conséquent, la qualité des cellules doit être correctement préservée et gérée dans le respect de conditions de culture spécifiques.

Notre système de surveillance de l’incubation CM30 simplifie ce processus en suivant à distance et de manière automatique les conditions de culture cellulaire à l’intérieur de l’incubateur, et ce, 24 heures sur 24, 7 jours sur 7. Il permet également de visualiser régulièrement l’état des cellules grâce à des résultats d’analyse basée sur l’IA. Grâce à des mesures continues et standardisées, le système CM30 permet aux opérateurs de quantifier de manière efficace et reproductible l’état des cellules de manière rationnelle.
 

Estimation de l’état des cellules de l’ensemble du récipient de culture cellulaire à partir d’observations multipoints

Pour préserver la qualité des cellules, il est important que les opérateurs observent et maintiennent l’état des cellules tous les jours. Par le passé, les opérateurs passaient beaucoup de temps et dépensaient beaucoup d’énergie à examiner l’ensemble du récipient de culture au microscope afin de déterminer l’état des cellules et le moment propice pour le repiquage et la collecte. Actuellement, même un opérateur expérimenté doit vérifier l’ensemble du récipient de culture, car l’ensemencement du milieu peut être inégal selon le type de cellule, le récipient de culture et la méthode utilisés.

Pour cette raison, le système CM30 peut prendre automatiquement et une fois par jour une image de l’ensemble du récipient de culture et de manière répétée de tout point d’observation particulier selon les besoins, ce qui permet à la caméra de continuer à prendre des images la position d’observation désirée tout en acquérant à intervalles réguliers des informations de l’ensemble du récipient de culture.

Toutefois, la collecte d’informations de l’ensemble du conteneur à chaque temps du processus de culture implique de nombreux risques matériels et logiciels. Par exemple, la manipulation des données est rendue compliquée par la durée d’acquisition importante et le grand volume de données. De plus, la température à l’intérieur de l’incubateur augmente sous l’effet du fonctionnement prolongé du système de surveillance. Aussi, les conséquences de ces changements environnementaux sur les cellules doivent être prises en compte.

Pour assurer la fiabilité des données tout en évitant ces risques, le système CM30 compte le nombre de cellules à différents temps (figure 1) définis en fonction de la taille du récipient de culture. Puis, il estime l’état des cellules de tout le récipient à partir de la moyenne des résultats d’analyse. Cela permet au système CM30 d’acquérir efficacement des données quantitatives avec peu d’erreurs dans les conditions de culture réelles.

Dans cet article technique, nous présentons les résultats de l’acquisition, de la comparaison et de la vérification de données quantitatives* effectuées avec le système CM30 pour confirmer la validité des estimations de l’état des cellules le l’ensemble du récipient de culture depuis de nombreux points différents.

*Cet article technique présente les résultats de vérifications faites en interne par Evident.

Figure 1 – Nombre de points d’observation multipoint de différents récipients de culture cellulaire.
 

Vérification comparative des estimations de numération cellulaire

Les types cellulaires et les récipients de culture suivants ont été utilisés pour comparer les résultats d’analyse des numérations cellulaires.

Type cellulaire, récipient de culture (nombre de points d’observation multipoint)

• Plaque de 12 puits A549 (9 points par puits)
• Flacon T75, NHEK (25 points)

Dans le système CM30, les mêmes paramètres analytiques ont été appliqués à l’ensemble du récipient de culture et à chacun des points d’observation définis pour chaque récipient de culture au même temps, et les résultats de la numération cellulaire ont été comparés. Afin de comparer les résultats tout au long du processus de prolifération cellulaire, nous avons également validé les résultats pour chacune des trois densités cellulaires : faible, moyenne et forte.

La vérification de la validité de l’observation multipoint du système CM30 a été réalisée en comparant la numération cellulaire de l’ensemble du récipient de culture estimée à partir de la moyenne des numérations cellulaires réalisées à différents points de chaque récipient et la numération cellulaire estimée à partir de l’observation de l’ensemble du récipient de culture en tant que valeur vraie des trois densités ci-dessus.

Afin de vérifier le degré de variation des numérations cellulaires lorsque ces dernières sont estimées pour l’ensemble du récipient à partir d’un seul point d’observation, nous avons comparé les numérations cellulaires de l’ensemble du récipient estimées à partir des numérations cellulaires maximale et minimale au niveau du point d’observation obtenu à la suite de l’observation globale ci-dessus et des numérations cellulaires réelles (valeurs vraies) pour l’ensemble du récipient.
 

Pertinence des observations multipoints réalisées avec un système de surveillance de l’incubation

La figure 2 ci-dessous illustre une comparaison des estimations de la numération (valeurs vraies) pour l’ensemble du récipient et des estimations de la numération obtenues d’après les observations multipoints d’une plaque de 12 puits et d’un flacon T75.

Figure 2 – Différence entre les estimations de la numération cellulaire pour l’ensemble du récipient de culture et à partir d’une observation multipoint

Habituellement, l’analyse de la numération et de la confluence des cellules est réalisée pour le contrôle qualité pendant le processus de préparation des cellules avec une précision de ± 10 % de la valeur vraie. Lors de cette validation, les valeurs pour l’ensemble du conteneur et l’estimation basée sur l’observation multipoint, que ce soit pour la plaque à 12 puits et le flacon T75, étaient dans la marge d’erreur de ± 2 % tout au long du processus de croissance cellulaire.

Par conséquent, nous avons constaté que les estimations obtenues à partir des observations multipoints de chaque récipient de culture fournissaient des données suffisamment fiables pour que nous n’ayons pas à observer l’ensemble du récipient de culture. Même dans les conditions les plus difficiles, comme une plaque de 12 puits avec un faible nombre de points d’observation par zone du récipient de culture, les valeurs estimées pour l’ensemble du récipient se situaient dans la marge d’erreur de ± 2 % tout au long du processus de croissance cellulaire. Donc, le nombre de points du système CM30 est considéré comme étant suffisant pour l’estimation de l’état des cellules de l’ensemble du récipient de culture.

Outre la validation de l’observation multipoint, nous avons testé la même méthode lorsque nous avons compté le nombre de cellules au niveau d’un seul point d’observation d’un récipient et avons estimé l’état des cellules de l’ensemble du récipient à partir des résultats (figure 2). Dans ce cas, nous avons constaté une erreur de numération de 60 et 129 % maximum pour, respectivement, la plaque de 12 puits et le flacon T75.

Afin de vérifier si ce résultat était dû à un ensemencement cellulaire inégal, nous avons utilisé une carte de degrés de variation des numérations cellulaires à travers le flacon T75 (figure 3). Les cases jaunes indiquent les zones dans lesquelles la numération cellulaire est supérieure de plus de 25 % à la numération cellulaire moyenne totale, tandis que les cases bleu clair indiquent les zones dans lesquelles la numération cellulaire est inférieure de 25 % à la moyenne. Les lignes rouges indiquent les zones d’observation multipoint du système CM30 (flacon T75), la case orange indique la zone dans laquelle le plus grand nombre de cellules a été observé et la case bleu foncé indique la zone dans laquelle le plus petit nombre de cellules a été détecté.

Les résultats de la vérification montrent que même un opérateur qualifié, qui réalise régulièrement des cultures cellulaires, peut rencontrer ce genre de variation d’ensemencement dans certaines zones. Cela montre également que le risque d’une estimation globale est très élevé lorsqu’un seul point d’observation se trouvant dans une zone qui s’écarte de la numération cellulaire moyenne de l’ensemble du récipient de culture.

Figure 3 – Carte de degrés de variation de la numération cellulaire dans le flacon T75

Étant donné que des irrégularités d’ensemencement peuvent survenir, l’estimation de l’état des cellules de l’ensemble du récipient de culture à partir d’un seul point d’observation présente un risque élevé d’obtention de résultats très différents de la numération cellulaire réelle, et ce, même si l’opérateur chargé de la culture cellulaire n’a rencontré aucun problème majeur. Cela démontre qu’il est difficile d’obtenir des données quantitatives à partir d’un seul point d’observation avec une reproductibilité élevée. Par exemple, lors de l’utilisation d’un dispositif de surveillance limité à un seul point d’observation, il est important d’observer plusieurs points en déplaçant la position du récipient à chaque fois pour quantifier l’état des cellules de l’ensemble du conteneur.
 

Conclusion

Notre validation comparative du système CM30 montre qu’il est possible d’estimer des données quantitatives proches de la véritable numération cellulaire pour l’ensemble du récipient à partir de la moyenne des numérations cellulaires réalisées en de nombreux points, sans qu’il soit nécessaire d’observer l’ensemble du conteneur. Cela démontre la validité de l’estimation de l’ensemble du récipient à partir de plusieurs points. Compte tenu du fait qu’un certain degré d’irrégularités d’ensemencement peut survenir, même lorsque l’opérateur est qualifié, l’estimation de la numération cellulaire pour l’ensemble du récipient de culture à partir d’un seul point d’observation présente, en outre, un risque élevé d’obtention de données très différentes de la numération cellulaire réelle.

Les résultats de cette étude suggèrent que les données quantitatives obtenues grâce à l’observation multipoint avec le système CM30 sont fiables pour le contrôle de la qualité des cellules. Ils suggèrent également que, même lors d’une simple vérification de l’état des cellules, il est important de tenir compte d’un certain degré d’irrégularités d’ensemencement et de réaliser une observation multipoint.

Outre les méthodes d’analyse ci-dessus, le système CM30 a été mis à jour pour améliorer les fonctions de numération et de détermination de la confluence des cellules ainsi que d’autres fonctions d’analyse. L’exactitude de l’analyse basée sur l’IA a également été améliorée grâce à l’ajout de réglages plus fins pour chaque paramètre d’analyse. Axé sur l’efficacité et la reproductibilité grâce à la surveillance quantitative des conditions de culture et à la réduction au maximum de la variabilité humaine, le système CM30 constitue une solution optimale pour les processus de culture cellulaire comprenant un grand nombre de tâches quotidiennes.
 

Auteur

Masatoshi Dehari
Solutions pour la recherche en sciences de la vie et Marketing international
Evident