ホーム/ アプリケーションノートFV3000と高性能対物レンズX Lineを用いたマウス透明脳の高精細広視野イメージング

FV3000と高性能対物レンズX Lineを用いたマウス透明脳の高精細広視野イメージング

高精細かつ広視野の3Dイメージング

神経細胞の接続を調べ上げるコネクトーム解析において、大規模のサンプルを対象に神経線維（突起）を正確に追跡する作業が必須となります。以前から、大きな薄い脳切片に対し、高精細な画像をずらしながら取得して連結する2Dタイリングが盛んに行われています。最近は、組織透明化技術の進歩により、分厚い脳サンプルに対して高精細な共焦点画像を異なる深度で何十枚も取得することが可能になり、神経線維のＺ軸方向における追跡精度向上が達成されてきました。今まさに、そうした高精細三次元再構築をＸＹに拡大すべき3Dタイリング機能が活躍すると期待されています。高効率の3Dタイリングに求められるのは、連結に必要な画像周辺部における光学性能であり、特に像面の平坦性（フラットネス）は神経線維を隣り合うタイル間で追跡するために最も重要な性能と言えます。

オリンパスのUPLXAPO-X Lineは、優れた周辺光学性能（フラットネス）を備えた対物レンズ群です。先述の要求に応えるべく、今回は60倍油浸対物レンズUPLXAPO60XOをオリンパス共焦点レーザー走査型顕微鏡FLUOVIEW FV3000に搭載し、蛍光標識された神経細胞を高密度に含むマウス脳の透明サンプルを用いて海馬CA1領域の三次元再構築を行いました。

組織透明化溶液：SCALEVIEW-S

本実験では、理化学研究所の宮脇敦史博士らにより開発されたScaleS法に基づいた組織透明化試薬SCALEVIEW-Sを使用しました。本溶液を用いて生体試料を透明化することで、試料を薄切することなく、蛍光タンパク質で標識された組織内部構造を深部まで高精細に観察することができます。SCALEVIEW-Sは透明化性能が高く、内在する蛍光タンパク質を長期間明るく保つことができるため、脳全体など広範囲にわたるコネクトーム解析に適しています。

蛍光色素染色：ChemScale プロトコル

図1: 蛍光色素染色：ChemScale プロトコル

高NAの油浸対物レンズUPLXAPO60XO

新型対物レンズシリーズUPLXAPO-X Line*は、従来の対物レンズに比べて、性能が大幅に向上しています。特に平坦性（フラットネス）は優れており、405 nmのような短波長でも視野中心部から周辺部まで均質な画像を取得することができるようになりました。中でも、60倍油浸対物レンズUPLXAPO60XOはNAが1.42と高く、解像度および明るさが格段と向上しています。今回の実験では、マウンティング溶液SCALEVIEW-SMtの屈折率が高いため、対物レンズも屈折率の高い油浸レンズUPLXAPO60XOを採用し観察しました。（*2019年6月発売）

広い視野で撮影、高精細に観察することに成功

今回の実験では、Thy1-YFP-H lineマウスの固定脳スライス（1 mm厚）をサンプルとし、ChemScaleプロトコル（図1）に準じ、DAPI染色および透明化処理を行いました。透明化された脳組織をSCALEVIEW-SMt液中でマウントし、共焦点レーザー走査型顕微鏡FV3000を用いて488 nm励起で神経細胞、および405 nm励起で細胞核の蛍光画像を取得しました。まず、低倍率対物レンズPLAPON1.25Xを用いて組織全体を俯瞰した画像を取得しました（図2 a）。その画像を参考にして、目的の領域（今回は海馬CA1付近）を、高倍率油浸対物レンズUPLXAPO60XOを用いて詳細にイメージングしました（図2 b, c）。さらに、三次元解析ソフトを用いて、取得した画像を三次元再構築しました（動画）。その結果、高精細でかつ深さのある蛍光画像を広い範囲で観察でき、画像境界面においても各神経線維がスムーズに繋がっていることが確認されました。

撮影画像

図2：透明化されたマウス脳の共焦点蛍光画像
a. PLAPON1.25Xを用いて撮影された脳スライス全体像
b. UPLXAPO60XOを用いて撮影された海馬CA1領域の2×3タイリング画像（20枚MIP）
c. bの一部拡大画像（20枚MIP）

サンプル条件
サンプル： Thy1-YFP-H line (15週齢、♂)、冠状断スライス (厚み1 mm)
透明化溶液： SCALEVIEW-S
マウンティング溶液： SCALEVIEW-SMt

撮影条件
顕微鏡： FV3000
レーザー： 405 nm (DAPI : 青)、 488 nm (EYFP : 黄色)
対物レンズ： UPLXAPO60X／NA 1.42、 PLAPON1.25X／NA 0.04(俯瞰撮影時のみ使用)
タイリング： 2 × 3
Zステップ： 0.4 μm

動画：海馬CA1領域における神経細胞および細胞核の三次元再構築蛍光画像

星田哲志先生からのコメント

高倍レンズを用いて広範囲に3Dイメージングすると、解像度が高く精細に観察できる一方、相対的に画像のズレが目立ちやすくなります。仮に視野周辺部に光学的湾曲等があれば、神経線維の繋ぎ合わせがうまくいかないなどの不具合が生じます。今回はフラットネス性の高い対物レンズUPLXAPO60XOを用いたことで、神経細胞の軸索や樹状突起などがきれいに繋がる良質の画像を描写できました。さらに、収差が激しく出やすい405 nm励起によるDAPIのタイリング画像でもシームレスに連結されており、全体的に歪みのない鮮明な画像が得られました。そのため、画像内にあるほとんどの細胞核のクロマチン構造まで三次元ではっきりと確認できました。

アプリケーションノート制作にご協力賜りました先生：
理化学研究所　脳神経科学研究センター　細胞機能探索技術研究チーム¹
光量子工学研究センター　生命光学技術研究チーム²

星田哲志先生

星田哲志先生^1,2
（本イメージング実験担当者）

濱裕先生

濱裕先生¹

Dr. Atsushi Miyawaki

宮脇敦史先生^1,2
（チームリーダー）

参考文献：
Hama, H., et al. : Nature Neuroscience, 14, 1481(2011).
Hama, H., et al. : Nature Neuroscience, 18, 1518(2015).
Hama, H., et al. : Protocol Exchange (2016), doi:10.1038/protex.2016.019
濱裕, 他. : 生体の科学, 68(1)：pp.85-93 (2017)
日置寛之, 他. : 日薬理誌, 149(4)：pp.173-179 (2017)
日置寛之, 他. : 生体の科学, 68(5)：pp.416-417 (2017)

実験を可能にしたオリンパスの技術

独自の新技術による高性能対物レンズ　X Line

対物レンズの製造には、高度な設計技術と精度の高い製造技術が必要不可欠です。オリンパスは独自のレンズ製造技術の新規開発により極薄レンズの製造に成功し、さらにそれを高精度のまま組み上げる技術を確立しました。トレードオフの関係にあるフラットネス、開口数そして色収差補正の3要素すべてを同時に高いレベルまで向上させることに成功しました。共焦点レーザー顕微鏡での使用の場合、405 nm励起による画質、フラットネスが著しく向上しています。