ロバート・フックが自ら制作した顕微鏡で立方体状に区切られた小部屋（細胞）を初めて観察してから、下村脩によるクラゲのエクオリンとGFPの研究、そしてXiaowei Zhuang博士による3D超解像イメージングのために新たな明滅色素分子の発明に至るまで、光学顕微鏡を使用した生命の小宇宙を探索する歩みは止まることを知りません。
第四次産業革命の一つの柱として、ナノテクノロジー工学は21世紀に発展し、当初は材料科学分野に応用されました。ナノテクノロジーがライフサイエンスと遭遇したとき、新たな蛍光ナノプローブという光を生み、ナノマテリアルの光で生命の小宇宙を輝かせることに成功しました。
蛍光顕微鏡の始まり
蛍光はフォトルミネセンスの一種で、光の吸収によって生じます。自然界には蛍光現象が無数に存在します。発光クラゲから抽出した緑色蛍光タンパク質（GFP）は、この現象を生物のミクロの世界に初めて実際に応用したものでした。1990年代初めの研究で、GFP遺伝子を他の生命体に導入して発現させると、もともと蛍光を発することがない生命体で緑色蛍光を発生させることが出来ることが明らかになりました。それ以降、科学者たちがGFPの構造とメカニズムを解析し、利用できるGFPの色、輝度、安定性などの性質に改良を加えた結果、バイオイメージングにおける蛍光タンパク質（FP）の開発と応用が大きく前進しました（図1）。
図1：ショウジョウバエ幼虫後腸のマルチカラー蛍光イメージング。黄色はF-アクチンを、緑色は核を、輝度表示ルックアップテーブル（LUT）は脂肪滴をそれぞれマーキングします。
蛍光タンパク質の種類は増加していますが、その応用範囲は未だ限定されています。蛍光タンパク質の発光スペクトルの幅は広く非対称であるため、同時マルチチャンネルイメージングではクロストークの問題があります。そこに、化学合成により、種類が豊富で、操作が簡単な有機色素が登場し、蛍光イメージングの応用範囲が大きく広がっただけでなく、商業生産も促進され、開発が飛躍するための確固とした基盤が築かれました。
ナノマテリアルによるバイオイメージングの目覚ましい進歩
有機色素が持つ短所（蛍光効率や光安定性の低さなど）は、蛍光イメージングの障害となることもありましたが、ナノマテリアルは固有の光学特性、指向性合成や会合などの利点があり、蛍光イメージングに新しい風を吹き込んでいます。現在、一般的な蛍光ナノマテリアルとしては以下が挙げられます（図2）。
- 半導体量子ドット（QD）
- アップコンバージョンレアアース材料（アップコンバージョンナノ粒子、UCNP）
- 貴金属ナノ粒子
他の色素と比べると、蛍光ナノマテリアルは高量子収率、高い安定性、大きなストークスシフト、広い励起スペクトル、狭い発光スペクトルといった長所があります。発光波長はサイズ調整することで変更できます。生体的適合性と認識・検知機能は、分子の組み立て方と修飾方法によって改善できます。つまり、ナノマテリアルは、蛍光標識にとって優れた可能性がある素材であり、蛍光イメージングの将来にも期待されています。
図2：有機ナノ粒子と無機ナノ粒子のサイズ、形、材料を示した図例
蛍光ナノプローブの基本ワークフロー
蛍光ナノプローブのエンジニアリングは、ナノケミストリーとバイオイメージングを含む学際的プロセスであるため、そのワークフローは従来のバイオイメージングとは異なります。理論計算、化学合成、バイオイメージング、さらには臨床試験をも含む多段階プロセスです（図3）。
図3：蛍光ナノプローブの基本ワークフロー
蛍光ナノプローブを使用した研究プロセスは、大半がアプリケーション指向です。蛍光ナノプローブを使用したバイオイメージングは、in vitroサンプルからin vivoライブイメージングにわたり、医療診断や医学研究にまで発展する可能性があります。したがって、ナノプローブの設計時には生物学的応用を考慮し、その特有のニーズに沿って、光学特性やその他の機能（近赤外光、アップコンバージョン、二光子など）を持つナノマテリアルを選択して合成し、特性解析を行って、高品質なナノマテリアルをスクリーニングします。その後、プローブの生体適合性や機能ニーズ（光学的操作、薬物搭載、分子認識など）を考慮して、さらなる修飾と組み立てを行います（図4）。
図4：緑色蛍光タンパク質（GFP）とクエン酸分子がコーティングされた官能基化金ナノプローブ（GNP）の3Dレンダリング
蛍光ナノプローブが関係する研究では、特性解析、高品質ナノマテリアルのスクリーニング、ナノプローブのin vivo検出の主に3つの領域に光学顕微鏡が活用されます。スクリーニングプロセスでは、各粒子に固有の構造不均一性によって、その特性に大きなばらつきが見られることがよくあります。多数の粒子の全体的な特性による従来の方法とは異なり、光学顕微鏡では単粒子レベルで高品質プローブのスクリーニングが可能であり、さらに構造機能相関を調べて設計合成の指針にすることができます。バイオイメージングでは、光学顕微鏡を使用して生体内ナノプローブの光シグナルを検出することで、その動的な時空間反応を追跡できます。
蛍光ナノプローブの研究応用と顕微鏡ソリューション
FV3000 Redシステムを使用した近赤外/アップコンバージョンイメージング
近赤外イメージングは、高生体組織透過性、低光毒性、組織の自家蛍光との干渉の低さという性質のおかげで、研究分野での光学顕微鏡法観察において近年特に注目されています。量子ドットなどの蛍光ナノプローブは、化学組成、形態、サイズを調整すれば、容易に近赤外励起を可能にできます。また、アップコンバージョンナノマテリアルには、近赤外イメージングに有用な光学特性があります。それは、長波長の光（NIR）で励起すると、励起光より短い波長の光（可視光またはUV光）を発する性質です。これらの特長により、アップコンバージョンナノプローブは新世代の蛍光バイオマーカーと見なされ、生物医学、エネルギーおよび触媒研究、その他の分野で重要な役割を果たすことが期待されています。
高感度でリアルタイムで行う肝毒性をin vivoで検出できることは、薬物性肝障害を診断する上で重要です。Li Huijun教授の研究グループが2020年に発表した論文によると、アップコンバージョンナノ粒子（UCNP）と金ナノロッド（GNR）を組み合わせて設計されたアップコンバージョンナノプローブが、薬物性肝障害のin situリアルタイム診断に応用されました。この新しいナノプローブは、肝臓内に集積し、肝障害マーカーmiR122によって特異的に活性化され、980nmの近赤外光で励起すると、800nmで蛍光画像が生成されます。発光共鳴エネルギー移動（LRET）やシグナル増幅テクノロジーと組み合わせると、miR122の高感度検出が可能なレベルまで検出感度が上がり、薬物性肝障害のリアルタイム臨床モニタリングを行うための新しい方法の可能性につながっています。[4]
従来の共焦点イメージングとは異なり、近赤外/アップコンバージョンナノプローブのイメージングには、以下に挙げる機能を持つ機器が必要です。
- 従来の共焦点顕微鏡で一般的に使用する励起波長は400～650nmであるのに対して、近赤外イメージングでは700nmより大きい波長を使用する近赤外レーザーが必要です。
- 従来のイメージングで使用する光路用部品（ガルバノスキャナー、対物レンズ、回折格子など）のほとんどは、可視光域のみで高い光学特性が確保されtいて、近赤外のイメージングには適していないことがありました。
- 近赤外域の検出には、750nm以上に対応した専用近赤外検出器が必要です。
これらの要件を満たすため、FLUOVIEW™ FV3000共焦点レーザー走査型顕微鏡には近赤外イメージングに対応したソリューションが用意されています（図5）。FV3000に730nmまたは785nmのダイオードレーザーと890nmまで明るく検出可能なGaAs PMT検出器を組み合わせたFV3000 Redシステムは、高感度での正確な近赤外イメージングに特化され、より多くの色を利用したイメージングを可能にします。
近赤外レーザー： 近赤外域に最適化された光学部品を使用： X Line™対物レンズ： 専用NIR検出器： |  |
図5：モジュール式FLUOVIEW FV3000共焦点レーザー走査型システムには、NIRイメージング用のFV3000 Redソリューションがあります。 |
Kai Li博士（南方科技大学、中国）の協力で作成されたこのアプリケーションノートでは、FV3000 RedによってNIR蛍光プローブのBTBベースのナノパーティクルの腫瘍標識性を細胞実験で実証しました（図６）。また、この研究の中では、Arg-Gly-Asp（RGD）ターゲティングペプチドでBTBナノプローブ表面を修飾したBTB-RGD NPナノプローブをマウスに注入し、48時間にわたり観察したところ、BTBナノプローブに比べて腫瘍部位のNIR-II蛍光シグナルが有意に増加を示したことも紹介されました。
図6：FV3000 RedでされたBTB−RGD NPsまたはBTB NPs条件下で4時間培養した、がん細胞（PC3, U87）と正常細胞（３T3）のNIR-I蛍光共焦点画像
【撮影条件】 励起波長：730nm、フィルター：760－890nm、スケール：50μm
FVMPE-RS™多光子励起レーザー走査型顕微鏡を使用したIn Vivoイメージング
がんは社会で最も重大な公衆衛生上の問題の1つです。悪性腫瘍を早期診断し、正確に切除することが、現在の医学研究では最優先されています。腫瘍マーカーの特異的同定と高解像度in vivoイメージングのために新たな蛍光ナノプローブを設計、開発することで、悪性腫瘍の早期医療診断と正確な外科的切除を可能にする新しい検出ソリューションを生み出す可能性が期待されています。
腫瘍細胞における酵素（アルカリホスファターゼ（ALP）など）の過剰発現は、腫瘍の発生、増殖、進行を示す重要な臨床指標です。したがって、ALP活性に対する高感度で迅速な検出方法は、腫瘍の早期発見と正確な切除に役立つと考えられています。2020年、Xiaojun Peng教授の研究チームが、まさにそれを目的に設計されたナノプローブの使用に関する論文を発表しました。この論文では、腫瘍細胞内で過剰発現したALPと相互作用して凝集する際に、強い蛍光を発するAIEgenプローブ（DQM-ALP）を設計、調製する方法が詳細に述べられていました。この改変されたナノプローブでは、従来の有機色素の凝集で生じていた蛍光消光の問題が回避されたため、腫瘍細胞内のプローブの検出感度と持続時間が向上しました。この研究では、酪酸ナトリウムとコルチゾールの刺激による腫瘍細胞内のALP活性の発現増加を初めて発見されました。実験では二光子顕微鏡を使用し、HeLaおよびHepG-2腫瘍スフェロイド内のALP活性について、高空間分解能の3次元深部イメージングを行いました。論文ではサブミリサイズの腫瘍の蛍光検出イメージングにおけるプローブの有用さが実証され、腫瘍の臨床診断と外科的切除にとって強力な支援ツールであることが論じられています。[5]
上記の研究では、一光子および二光子の共焦点顕微鏡が使用されました。また一方、in vivo深部蛍光イメージング用に設計された最新のFVMPE-RS多光子励起レーザー走査型顕微鏡は、専用の高速レゾナントガルバノスキャナーと高感度の検出光路を備え、腫瘍マーカーの高解像度3次元深部イメージングの正確さと効率性をさらに高めます（図7）。
FVMPE-RSシステムのデュアルライン/デュアルレーザーと最大4チャンネルの高感度検出を組み合わせることによって、さらに柔軟性の高いマルチカラー同時イメージングに対応でき、検出スループットと効率が一段と向上します。また、独立した光刺激スキャナーを使用して、フェムト秒レーザーによる精密な空間刺激が可能です。この精密な刺激と高速の同時シグナル取得は、光による応答制御、その他の特殊なナノプローブ検出用途に非常に効果的です。
効率的な赤外励起： 深部観察： 高速スキャン： マルチカラー多光子イメージング： より柔軟性のある光刺激： |  |
図7：深部イメージング用モジュール付きのFVMPE-RS多光子励起レーザービーム顕微鏡 |
IXplore™ SpinSRスピニングディスク型共焦点超解像システムを使用した生細胞内のナノプローブの動的検出
生化学反応や生細胞内の他の分子事象は、重要な時空間動的特性を持つことがよくあります。光学イメージングテクノロジーでは、ナノプローブの動きを正確に追跡し、生体分子との相互作用を観察することができます。これらのバイオマーカーを効果的にモニタリングして、動的変化を観察することによって、その状態と関連する細胞機能との関係をさらに探求できます。エンドソームやリソソームなどのオルガネラ（細胞内小器官）は、シグナル伝達や代謝恒常性の維持において重要な役割を果たします。これらのオルガネラのpHはエンドサイトーシス時に変化するので、エンドサイトーシス過程の動的モニタリングと、オルガネラの状態と細胞機能との関係の探索において、pH値を高速・高感度で検出することが研究のポイントとなります。
2016年、北京大学のYiguang Wang教授とテキサス大学Southwestern Medical CenterのJinming Gao教授の研究チームが論文を発表し、単一オルガネラレベルの分解能での超高感度pHナノプローブ（HyUPS）を設計したことを明らかにしました。このナノプローブを使用して、エンドサイトーシス時にエンドソームやリソソームなどのオルガネラで見られるpH変化が追跡・検出されました。プローブには、エンドサイトーシスの3つの成分と3つのpH範囲に対応する3つのpH検出成分が含まれ、それぞれ赤色、緑色、青色の蛍光色素で標識されました。このプローブを使用して、生細胞内のエンドサイトーシスに関与するオルガネラの酸性化速度について、リアルタイムのマルチカラー動的モニタリングに成功しました。こうして、エンドソーム/リソソームの機能障害による疾患を詳細に研究するための新たなイメージングツールが生まれました。[6]
生体試料のナノプローブイメージングには高速のイメージング機器が必要ですが、従来のポイントスキャン型共焦点法では要件に合いません。IXplore SpinSRスピニングディスク型共焦点超解像システムは、超解像品質（110nm）で高速（200fps）マルチカラーイメージングが可能です（図8）。これらの機能により、構造体の動的過程を高速で取得でき、ライフサイエンス研究者がイメージング効率を向上するための強力なツールとなっています。専用のRTCe（リアルタイムコントローラー）がすべてのコンポーネントを同時制御し、サンプルへの励起光の影響を最小限に抑えます。これに深部ライブイメージング用に設計されたシリコーンオイル浸対物レンズを組み合わせれば、生細胞、スフェロイド、オルガノイドなどのサンプルにおいて、長時間の正確な深部イメージングが可能です。
図9で、PKMDR染色された上皮細胞ミトコンドリアを示す、IXplore SpinSRシステムの超解像イメージングの一例をご覧ください。北京大学のZhixing Chen教授により開発されたPKMDRは、蛍光およびナノスケールイメージングの光毒性を最小限に抑えるミトコンドリアプローブです。
IXplore SpinSRスピニングディスク型共焦点超解像システム
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図8：IXplore SpinSRスピニングディスク型共焦点超解像システム |
図9：IXplore SpinSRシステム、UPLAPO60XOHR対物レンズ、TruSight™デコンボリューションを使用した、PKMDR染色した上皮細胞ミトコンドリアの超解像イメージング。画像提供：Huiwen Hao博士、Junsheng Yang博士、Yujie Sun教授、Zhixing Chen教授、Standard Imaging Co., Ltd、Sun Lab、College of Future Technology、PKU、NanJing GenVivo Biotech Co., Ltd.
過去10年における、ナノテクノロジーと光学イメージングテクノロジーの急速な発展に伴い、蛍光ナノプローブを使用した生化学イメージングの応用では数多くの重要な進歩が見られました。しかし、蛍光ナノプローブの応用は、生体適合性や、蛍光の明滅動作の存在などの短所があるため、現在はまだ限定的です。ナノマテリアルやバイオイメージングテクノロジー、化学合成、理論物理学、画像解析などと協調して継続的な開発が進むことにより、蛍光ナノプローブバイオイメージングの特異性、正確性、安定性、再現性を向上することが期待され、より広い研究分野で重要な役割を果たす可能性が高まっています。
参考文献：
[2]. Chang, H., Xie, J., Zhao, B., Liu, B., Xu, S., Ren, N., Xie, X., Huang, L., & Huang, W. (2014). Rare Earth Ion-Doped Upconversion Nanocrystals: Synthesis and Surface Modification. Nanomaterials (Basel, Switzerland), 5(1), 1–25.
[3]. Chen, Z., Wu, X., Hu, S., Hu, P., & Liu, Y. Multicolor upconversion NaLuF4 fluorescent nanoprobe for plant cell imaging and detection of sodium fluorescein. J. Mater. Chem. C, 2015, 3, 153-161
