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2016年 12月 09日

オートファジーアプリケーション

2016年ノーベル生理学・医学賞を受賞された大隅良典・東京工業大学栄誉教授によって解明された、「オートファジー(自食作用)」の研究は光学顕微鏡による酵母の観察から始まりました。
現在多くの研究者によって、オートファジー研究は酵母のほか、哺乳類などの動物細胞へも拡がり、世界的に展開されています。
これにより、オートファジーの分子レベルの機能解明や生体内での役割、およびアルツハイマー病などの神経疾患とのかかわりを調べるといった、基礎的研究から臨床応用まで、オリンパスの生物顕微鏡は最先端のオートファジー研究へ貢献しています。


TIRF専用150倍・高NA対物レンズ、倒立型リサーチ顕微鏡IXシリーズを用いた出芽酵母(Atg17変異株)におけるオートファジー関連タンパク質Atg17、液胞膜の偏射蛍光観察

Atg17(GFP)
Atg17(GFP)
液胞膜(Vph1-mCherry)
液胞膜(Vph1-mCherry)
マージ画像 Atg17(緑)、液胞膜(マゼンタ)
マージ画像
Atg17(緑)、液胞膜(マゼンタ)

東京工業大学 大隅ラボ のTIRF 顕微鏡
東京工業大学 大隅ラボ のTIRF 顕微鏡

画像データのご提供;
東京工業大学 科学技術創成研究院 細胞制御工学研究ユニット
山本 林先生、大隅 良典先生

参照論文;
Yamamoto H, Fujioka Y, Suzuki SW, Noshiro D, Suzuki H, Kondo-Kakuta C, Kimura Y, Hirano H, Ando T, Noda NN, Ohsumi Y. The Intrinsically Disordered Protein Atg13 Mediates Supramolecular Assembly of Autophagy Initiation Complexes. Dev Cell. 2016 Jul 11;38(1):86-99.

関連製品:150倍TIRF専用対物レンズ UAPON150XOTIRF


蛍光3色同時観察対応のレーザー顕微鏡システム(電動倒立型リサーチ顕微鏡IXシリーズ ベース)を用いたCOS7細胞内におけるオルガネラ、オートファゴゾオームの蛍光3色同時観察。

網目状ミトコンドリア(RFP-SEC61β、赤)と小胞体(TFP-mito、青)
網目状ミトコンドリア(RFP-SEC61β、赤)と小胞体(TFP-mito、青)がダイナミックに動きながら、両オルガネラが接触しているポイントでオートファゴゾーム(YFP-ATG5、緑)が造られる様子を世界で初めて撮影することに成功。

当時の蛍光3色同時観察システム
当時の蛍光3色同時観察システム
現在の蛍光3色同時観察システム
現在の蛍光3色同時観察システム
Live-cell imaging microscope system in Yoshimori labo, Osaka University

左画像は実際に「Nature」論文中のFigure画像撮影に使用された当時の蛍光3色同時観察用レーザー顕微鏡システム(顕微鏡は電動倒立型リサーチ顕微鏡IX81)、右画像は電動倒立型リサーチ顕微鏡IX83にアップグレードされた現在のシステム。

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nature11910 sv1

 

画像データのご提供;
大阪大学大学院 医学系研究科 遺伝医学講座 遺伝学教室
濱﨑 万穂先生、吉森 保先生

参照論文;
Maho Hamasaki, Nobumichi Furuta, Atsushi Matsuda, Akiko Nezu, Akitsugu Yamamoto, Naonobu Fujita, Hiroko Oomori, Takeshi Noda, Tokuko Haraguchi, Yasushi Hiraoka, Atsuo Amano, & Tamotsu Yoshimori.
Autophagosomes form at ER-mitochondria contact sites.
Nature. 2013 Mar 21;495(7441):389-93. doi: 10.1038/nature11910. Epub 2013 Mar 3.

関連製品:電動倒立型リサーチ顕微鏡 IX83


30倍シリコーン浸対物レンズUPLSAPO30XS、共焦点レーザー走査型顕微鏡FVシリーズを用いたGFP-LC3-RFP-LC3ΔG トランスジェニックゼブラフィッシュ受精卵深部におけるオートファジー関連タンパク質LC3のライブイメージング

トランスジェニックゼブラフィッシュ受精卵深部におけるオートファジー関連タンパク質LC3のライブイメージング

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UPLSAPO30XS zebrafish fertilized egg

 

画像データのご提供;
東京大学 大学院医学系研究科 分子生物学分野
森下 英晃先生、水島 昇先生

参照論文;
Takeshi Kaizuka, Hideaki Morishita, Yutaro Hama, Satoshi Tsukamoto, Takahide Matsui, Yuichiro Toyota, Akihiko Kodama, Tomoaki Ishihara, Tohru Mizushima, Noboru Mizushima
An Autophagic Flux Probe that Releases an Internal Control.
Mol Cell. 2016 Oct 25. pii: S1097-2765(16)30589-5. doi: 10.1016/j.molcel.2016.09.037. [Epub ahead of print]

関連製品:共焦点レーザー走査型顕微鏡 FV300030倍シリコーン浸対物レンズUPLSAPO30XS


オートファジー関連タンパク質ATG3をノックアウトしたマウス胚性線維芽細胞飢餓条件下(1時間後)における膜融合タンパク質SNARE(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)の局在解析。

膜融合タンパク質の局在解析
野生型(左)、ATG3ノックアウト(右)マウス胚性線維芽細胞に発現しているSNAREタンパク質SECFP-STX17 とmyc-SNAP29が共局在(白矢印)しているのが観察された。
スケールバーは10μm、拡大した画像(白枠)のスケールバーは2μm。

東京大学 水島ラボ の共焦点レーザー走査型顕微鏡
東京大学 水島ラボ の共焦点レーザー走査型顕微鏡

画像データのご提供;
東京大学 大学院 医学系研究科 分子生物学分野
坪山 幸太郎先生、本田 郁子先生、水島 昇先生

参照論文;
Kotaro Tsuboyama, Ikuko Koyama-Honda, Yuriko Sakamaki, Masato Koike, Hideaki Morishita, Noboru Mizushima.
The ATG conjugation systems are important for degradation of the inner autophagosomal membrane.
Science 20 Oct 2016: DOI: 10.1126/science.aaf6136.

関連製品:共焦点レーザー走査型顕微鏡 FV3000


ディスク共焦点超解像システムSD-OSR、100倍シリコーン浸対物レンズUPLSAPO100XSを用いたマウス繊維芽細胞内部におけるオートファゴゾーム膜のライブ超解像イメージング

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VID2

 

 SD-OSR (Left side of movie)

  • GFP-p62 expressing  MEF
  • AA(-) for 35 min
  • Laser 488 nm ; intensity: 40
  • Exposure: 1000 msec
  • Interval: 0 sec
  • UPLSAPO100XS (silicone oil) 
  • Glass bottom dish with TOKAI HIT, MI-IDC
  • Scale bar: 1 μm 

Confocal (Right side of movie)

  • GFP-p62 expressing  MEF
  • AA(-) for 38 min
  • Laser 488 nm ; intensity: 20
  • Exposure: 200 msec
  • Interval: 0 sec
  • UPLSAPO100XS (silicone oil)
  • Glass bottom dish with TOKAI HIT, MI-IDC
  • Scale bar: 1 μm 

マウス繊維芽細胞に発現しているGFP-p62を35分間連続で超解像イメージング(左)。
共焦点イメージング(右)と比較してもオートファゴゾーム膜がよりクリアなリング状として観察できている。

画像データのご提供;
福島県立医科大学 解剖・組織学講座
和栗 聡先生

関連製品:ディスク共焦点超解像システム SD-OSR

SD-OSRは個別対応品につき、詳細はお問い合わせください。


オートファジー誘導条件(アミノ酸不含培地で培養1.5時間後)でPFA固定したマウス胚性線維芽細胞におけるオートファゴソーム形成因子WIPI2(AlexaFluor488)とミトコンドリア外膜タンパク質TOM20 (AlexaFluor568)をFV3000超解像ソフトウェアFV-OSRで超解像イメージング。

オートファジー誘導条件でPFA固定したマウス胚性線維芽細胞におけるオートファゴソーム形成因子WIPI2とミトコンドリア外膜タンパク質TOM20
連続断層像を撮影し、横断面を表示。右は超解像XYZ画像に対しソフトウェアcellSens Demensionの3Dデコンボリューション処理を行いZ分解能を向上させた。

画像データのご提供;
東京大学 大学院医学系研究科 分子生物学分野
本田 郁子先生、水島 昇先生

関連製品:FV3000 超解像ソフトウェア FV-OSR


細胞生物学から基礎医学、ウイルス、免疫、植物研究までオリンパスの生物顕微鏡はさまざまな最先端のオートファジー研究へ貢献しております。

-オートファジー研究に使用されたオリンパス生物顕微鏡(2016年主要文献)-

Takeshi Kaizuka, Hideaki Morishita, Yutaro Hama, Satoshi Tsukamoto, Takahide Matsui, Yuichiro Toyota, Akihiko Kodama, Tomoaki Ishihara, Tohru Mizushima, Noboru Mizushima
An Autophagic Flux Probe that Releases an Internal Control.
Mol Cell. 2016 Oct 25. pii: S1097-2765(16)30589-5. doi: 10.1016/j.molcel.2016.09.037. [Epub ahead of print]
関連製品:30倍シリコーン浸対物レンズUPLSAPO30XS

Kotaro Tsuboyama, Ikuko Koyama-Honda, Yuriko Sakamaki, Masato Koike, Hideaki Morishita, Noboru Mizushima.
The ATG conjugation systems are important for degradation of the inner autophagosomal membrane.
Science 20 Oct 2016: DOI: 10.1126/science.aaf6136.
関連製品:共焦点レーザー走査型顕微鏡 FV3000

Kenta Imai, Feike Hao, Naonobu Fujita, Yasuhiro Tsuji, Yukako Oe, Yasuhiro Araki, Maho Hamasaki, Takeshi Noda, Tamotsu Yoshimori.
J Cell Sci. 2016 Oct 15;129(20):3781-3791. Epub 2016 Sep 1.
関連製品:共焦点レーザー走査型顕微鏡 FV3000

Kosaku Shinoda, Yutaka Hasegawa, Kenji Ikeda, Haemin Hong, Qianqian Kang, Yangyu Yang, Rushika M. Perera, Jayanta Debnath, Shingo Kajimura.
Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance Svetlana Altshuler-Keylin.
Cell Metab. 2016 Sep 13;24(3):402-19. doi: 10.1016/j.cmet.2016.08.002. Epub 2016 Aug 25.
関連製品:マクロ蛍光顕微鏡MVX10

Junya Hasegawa, Ryo Iwamoto, Takanobu Otomo, Akiko Nezu, Maho Hamasaki, Tamotsu Yoshimori.
Autophagosome–lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome.
EMBO J. 2016 Sep 1;35(17):1853-67. doi: 10.15252/embj.201593148. Epub 2016 Jun 23.
関連製品:共焦点レーザー走査型顕微鏡 FV3000

Christopher P Webster, Emma F Smith, Claudia S Bauer, Annekathrin Moller, Guillaume M Hautbergue, Laura Ferraiuolo, Monika A Myszczynska, Adrian Higginbottom, Matthew J Walsh, Alexander J Whitworth, Brian K Kaspar, Kathrin Meyer, Pamela J Shaw, Andrew J Grierson, Kurt J De Vos.
The C9orf72 protein interacts with Rab1a and the ULK1 complex to regulate initiation of autophagy.
EMBO J. 2016 Aug 1;35(15):1656-76. doi: 10.15252/embj.201694401. Epub 2016 Jun 22.
関連製品:電動倒立型リサーチ顕微鏡 IX83

Hayashi Yamamoto, Yuko Fujioka, Sho W. Suzuki, Daisuke Noshiro, Hironori Suzuki, Chika Kondo-Kakuta, Yayoi Kimura, Hisashi Hirano, Toshio Ando, Nobuo N. Noda & Yoshinori Ohsumi.
The Intrinsically Disordered Protein Atg13 Mediates Supramolecular Assembly of Autophagy Initiation Complexes.
Dev Cell. 2016 Jul 11;38(1):86-99.
関連製品:150倍TIRF専用対物レンズ UAPON150XOTIRF

Chantal Sellier, Maria‐Letizia Campanari, Camille Julie Corbier, Angeline Gaucherot, Isabelle Kolb‐Cheynel, Mustapha Oulad‐Abdelghani, Frank Ruffenach, Adeline Page, Sorana Ciura, Edor Kabashi, Nicolas Charlet‐Berguerand.
Loss of C9ORF72 impairs autophagy and synergizes with polyQ Ataxin‐2 to induce motor neuron dysfunction and cell death.
EMBO J. 2016 Jun 15;35(12):1276-97. doi: 10.15252/embj.201593350. Epub 2016 Apr 21.
関連製品:電動倒立型リサーチ顕微鏡 IX83

Jennifer Martinez, Larissa D. Cunha, Sunmin Park, Mao Yang, Qun Lu, Robert Orchard, Quan-Zhen Li, Mei Yan, Laura Janke, Cliff Guy, Andreas Linkermann, Herbert W. Virgin & Douglas R. Green.
Noncanonical autophagy inhibits the autoinflammatory, lupus-like response to dying cells.
Nature. 2016 May 5;533(7601):115-9. doi: 10.1038/nature17950. Epub 2016 Apr 20.
関連製品:システム生物顕微鏡 BX53

Shuo Wang, Pengyan Xia, Guanling Huang, Pingping Zhu, Jing Liu, Buqing Ye, Ying Du & Zusen Fan.
FoxO1-mediated autophagy is required for NK cell development and innate immunity.
Nat Commun. 2016 Mar 24;7:11023. doi: 10.1038/ncomms11023.
関連製品:共焦点レーザー走査型顕微鏡 FV3000

Jiwon Jang, Yidi Wang, Matthew A. Lalli, Elmer Guzman, Sirie E. Godshalk, Hongjun Zhou, Kenneth S. Kosik.
Primary Cilium-Autophagy-Nrf2 (PAN) Axis Activation Commits Human Embryonic Stem Cells to a Neuroectoderm Fate.
Cell. 2016 Apr 7;165(2):410-20. doi: 10.1016/j.cell.2016.02.014. Epub 2016 Mar 24.
関連製品:倒立型リサーチ顕微鏡 IX73

Takeshi Yamamoto, Yoshitsugu Takabatake, Tomonori Kimura, Atsushi Takahashi, Tomoko Namba, Jun Matsuda, Satoshi Minami, Jun-ya Kaimori, Isao Matsui, Harumi Kitamura, Taiji Matsusaka, Fumio Niimura, Motoko Yanagita, Yoshitaka Isaka & Hiromi Rakugi.
Time-dependent dysregulation of autophagy: implications in aging and mitochondrial homeostasis in the kidney proximal tubule.
Autophagy. 2016 May 3;12(5):801-13. doi: 10.1080/15548627.2016.1159376. Epub 2016 Mar 17.
関連製品:共焦点レーザー走査型顕微鏡 FV3000

Chenran Wang, Song Chen, Syn Yeo, Gizem Karsli-Uzunbas, Eileen White, Noboru Mizushima, Herbert W. Virgin, and Jun-Lin Guan.
Elevated p62/SQSTM1 determines the fate of autophagy-deficient neural stem cells by increasing superoxide.
J Cell Biol. 2016 Feb 29;212(5):545-60. doi: 10.1083/jcb.201507023.
関連製品:顕微鏡用デジタルカメラ DP74

Satoshi Hirano, Takefumi Uemura, Hiromichi Annoh, Naonobu Fujita, Satoshi Waguri, Takashi Itoh & Mitsunori Fukuda.
Differing susceptibility to autophagic degradation of two LC3-binding proteins: SQSTM1/p62 and TBC1D25/OATL1.
Autophagy. 2016;12(2):312-26. doi: 10.1080/15548627.2015.1124223.
関連製品:100倍TIRF専用対物レンズ UAPON100XOTIRF

Qun Lu, Christine C. Yokoyama, Jesse W. Williams, Megan T. Baldridge, Xiaohua Jin, Brittany DesRochers, Traci Bricker, Craig B. Wilen, Juhi Bagaitkar, Ekaterina Loginicheva, Alexey Sergushichev, Darren Kreamalmeyer, Brian C. Keller, Yan Zhao, Amal Kambal, Douglas R. Green, Jennifer Martinez, Mary C. Dinauer, Michael J. Holtzman, Erika C. Crouch, Wandy Beatty, Adrianus C.M. Boon, Hong Zhang, Gwendalyn J. Randolph, Maxim N. Artyomov, Herbert W. Virgin.
Homeostatic Control of Innate Lung Inflammation by Vici Syndrome Gene Epg5 and Additional Autophagy Genes Promotes Influenza Pathogenesis.
Cell Host Microbe. 2016 Jan 13;19(1):102-13. doi: 10.1016/j.chom.2015.12.011.
関連製品:システム生物顕微鏡 BX53

Yurong Li, Mehdi Kabbage, Wende Liu, and Martin B Dickman.
Aspartyl protease mediated cleavage of AtBAG6 is necessary for autophagy and fungal resistance in plants.
Plant Cell. 2016 Jan;28(1):233-47. doi: 10.1105/tpc.15.00626. Epub 2016 Jan 6.
関連製品:共焦点レーザー走査型顕微鏡 FV3000

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