グラディエントコントラスト法のご紹介

はじめに

光学顕微鏡は、16世紀の発明当初より微生物や赤血球の発見をはじめとした生物学の研究に貢献してきました。19世紀に標本染色技術が発達し、透明な構造も色を付けて見やすくなりましたが、染色には毒性があるため、生きた標本に使用するには制限がありました。20世紀になってから、位相差観察法をはじめとした非染色で透明物体を見るための様々な方法が開発され、生物学研究において欠かせない道具となっています。

位相可視化法の種類

ここでは、非染色で透明物体を見るための位相可視化法を、それぞれの光学素子配置を図1に示して簡単に説明します。従来の位相可視化法は、コンデンサー瞳と対物レンズ瞳にそれぞれ特定の光学素子を配置することにより実現しています。位相差観察法（図1a）は、輪帯開口を持つ専用のコンデンサーレンズと輪帯位相膜の付いた専用の対物レンズを組み合わせて用います。コンデンサー瞳の輪帯開口を通過した光線は対物レンズ瞳において、標本を直進した成分は位相膜を透過し、標本で屈折した成分は位相膜以外の部分を透過するため、両成分が干渉する部分に明暗のコントラストが発生します。標本内の屈折率分布の段差部分にハローと呼ばれる光の滲みがつくことが特徴です。厚い標本は、このハローが強く現れるため不向きでした。微分干渉観察法（図1b）は、コンデンサー瞳と対物レンズ瞳位置に相補的なウォラストンプリズムを配置した偏光型シアリング干渉計です。標本像は一定方向に少しだけずれた二重像となり、標本の屈折率段差部分に影がついて立体的に見えるようになります。偏光干渉を利用しているため、光路中にプラスチックシャーレなど光学歪みのあるものがあると観察ができません。変調コントラスト観察法（図1c）は、コンデンサー瞳のスリット開口で光線を一方向に制限することで、対物レンズ瞳のモジュレーターにより、標本での直進成分は灰色部分を透過します。屈折成分はその方向に応じて透明部分を透過するか、遮蔽部分で遮蔽されることで、微分干渉観察法同様に立体的な像が得られます。偏光を利用していないため、プラスチックシャーレなど光学歪みのある標本でも用いることができるのが特徴です。照明のNAが小さいので、他の方法と比較して解像がやや低下します。

図１．各種位相可視化法の光学配置

各種位相可視化法の光学素子を示した図。
a. 位相差観察法、b. 微分干渉顕微鏡法、c. 変調コントラスト法、d. グラディエントコントラスト法。

グラディエントコントラスト法

グラディエントコントラスト法（図1d）は、対物レンズ瞳にグラディエントNDフィルターを挿入することにより、微分干渉観察法と同様に立体的な像として観察できることが特徴です。

グラディエントコントラスト法の原理

対物レンズの瞳位置に挿入されたグラディエントNDフィルターは、透過率が一方向に単調に減少していることが特徴です。対物レンズの瞳位置に投影されるコンデンサーレンズの開口径は、対物レンズ瞳径に対してある程度小さくしています。標本の屈折率分布が平らな場所においては、コンデンサーレンズの開口像は対物レンズの瞳の中心位置に結像し、グラディエントNDフィルターの中心付近の透過率の影響を受けます（図2a）。標本の屈折率分布に傾きがあると、その場所において光線が屈折することにより、コンデンサーレンズの開口像はグラディエントNDフィルターの中心から偏心して結像し、グラディエントNDフィルターにより全体の透過率が変化します（図2b、c）。そのため、標本の屈折率の傾斜に応じた明るさで結像され、標本の屈折率分布が立体的に見えるようになります（図2d）。コンデンサーレンズの開口径はASで調整可能ですが、比較的大きな場合は標本の屈折率傾斜による明るさの変化が少ないことがあります。その場合、撮像素子で撮像した画像に強調処理を行い、見やすいようコントラストを上げて表示します。

図2．グラディエントコントラスト法の作用原理説明図

グラディエントコントラスト法で位相物体に明暗のコントラストがつく原理を説明したもの。
a. 標本の位相分布が平坦な部分は光線が直進し、グラディエントNDフィルターの中央付近を透過します。
b, c. 標本の位相分布が傾いている場合は光線が屈折し、傾きの方向によりグラディエントNDフィルターの明るい部分を透過したり（b）、暗い部分を透過したり（c）します。
d. 観察像は、標本の位相分布の傾斜の向きに応じて明暗のコントラストがついて観察されます。

グラディエントコントラスト法の特長

グラディエントコントラスト法による位相画像は、位相差観察法のようにハローが発生することがないので、厚い標本にも適用可能です。また、微分干渉観察法のように偏光を用いることもないので、光歪みを含むブラスチックシャーレ内の標本にも用いることができます。更に、照明のNAが他の方法より大きいので、水滴の付いたシャーレのフタを通しても影響を受けにくく、また変調コントラスト法のような解像の劣化を防ぐことができます。専用の対物レンズや対物レンズ変換時の素子切替操作が不要なことも、実用上の大きな利点です。

グラディエントコントラスト法を実現する光学構成

APX100の構成を簡易図で示しました。光源からの光は、以下の光学部組を通じて標本へ照射され、撮像面で結像します。対物レンズの瞳位置と共役な位置に、グラディエントNDフィルターが配置されます。観察法がグラディエントコントラスト法のときのみ、本フィルターが光路中へ入ります。コンデンサーの開口径は、対物レンズの倍率と瞳径に応じて、最適な径へ調整されます。

アプリケーション

各観察方法による見え方を、画像で比較しました。容器①と②におけるHela細胞を、10倍の対物レンズで観察しています。

①ガラスボトムディッシュ（プラスチックの上蓋有り）
②12ウェルマイクロプレート（プラスチックの上蓋内に水滴が付着）

比較結果：

①グラディエントコントラスト法は位相差観察法/変調コントラスト法と同程度のコントラスト。微分干渉観察法ではプラスチックの蓋で偏光性能が低下するため、コントラストが低い。
②他観察法と比べ、グラディエントコントラスト法は視野ムラが少なくコントラストが良い。グラディエントコントラスト法では照明のNAが他観察法より大きく、標本上の異物の影響を受けにくいため。

まとめ

グラディエントコントラスト法は、対物レンズ瞳にグラディエントNDフィルターを追加しただけの簡単な構成による、透明な標本を無染色で観察するのに適した位相物体観察法です。従来の位相物体観察法と比較して、以下のようなユーザーメリットが挙げられます。

• 専用対物レンズが不要（ほとんどのエビデント製対物レンズに対応）
• メニスカス、容器の蓋、水滴の影響を低減
• ガラスおよびプラスチック底の各種容器で使用可能
• 立体感のある高コントラストな画像が取得可能
• コンタミネーションのリスクも低減

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