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最先端の光学技術でデジタル画像処理技術を切り拓くX Line 対物レンズ

はじめに

顕微鏡の光学性能を決定づける最も重要なパーツである対物レンズは、その設計・製造に⾮常に⾼度な技術とナノオーダーの精度が要求されます。オリンパスは、光学機器メーカーとしての100年にわたるノウハウ、および、独⾃の製造技術をさらに高めることで、光学性能の基本要素であるNA(Numerical Aperture:開口数)、フラットネス(像平坦性)、⾊収差補正(Chromatic Correction)の3要素の性能全てを、これまで実現不可能と考えられてきた領域まで向上した、最先端の対物レンズ X Line を開発しました。

オリンパスの顕微鏡の詳細な歴史はこちら

背景

近年、sCMOSカメラなどの広視野カメラの普及により、広視野でも中⼼から周辺まで視野全体にわたり均質で鮮明な画像データを取得するニーズが⾼まっています。広視野全体にわたって均質で鮮明な画像データを取得し、信頼性の高い演算処理結果を提供するためには、トレードオフの関係にある3要素を同時に満たす必要があり、技術的なブレークスルーが必須でした。

背景
 

トレードオフ関係にあるNA、フラットネス、⾊収差補正を同時に改善したX Line対物レンズ 

3要素の性能向上におけるトレードオフの具体例を⽰します。例えば、従来製造技術の制限範囲で開発した対物レンズUPLSAPO60XO(NA1.35)およびPLAPON60XO(NA1.42)では、NAを1.35から1.42に改善しようとすると、⾊収差補正が可能な波⻑域は435〜1,000nmから435〜656nmへ著しく狭くなり、フラットネスも若⼲悪化してしまいます(図1)。このように、従来の製造技術ではNA、フラットネスおよび⾊収差補正を同時に改善することは困難でした。
今回、オリンパスの製造技術をさらに高めた結果、X Line(UPLXAPO60XO)では、NA1.42を保ちながら⾊収差補正波⻑域を400〜1,000nmに拡⼤し、同時にフラットネスの⼤幅な向上を実現しました(図1)。X Line は、オリンパスの従来製品だけでなく他社製品と⽐べても極めて⾼品位な光学性能を保有します。これにより、広視野顕微鏡画像の明るさ、分解能、画質の均質度を⼤幅に改善でき、より正確な画像の提供が可能となりました。

X Lineは、モノづくりに対する技術的な壁を打開し、対物レンズの重要な要素であるNA、フラットネスおよび⾊収差補正を同時に⾼レベルで向上させた、他の追随を許さない対物レンズです。

図1. 新しい製造技術によりNA、像平坦性、色収差補正を同時に改善したX Line対物レンズ

図1. 従来対物レンズとX Lineとの性能⽐較
 

広視野・⾼精細イメージングにとって重要な要素

●NA(Numerical Aperture : 開口数)

NAは、対物レンズが光を集める範囲の指標で、分解能、焦点深度、像の明るさを決める要素です。NAが⼤きいほど広範囲の光を集めることで明るい像を取得でき、同時に分解能も向上します。極めて微⼩な構造の観察や、蛍光観察など微弱な光の観察の際に重要な指標です。
新しい40倍対物レンズUPLXAPO40XOでは、⾊収差補正波⻑範囲と広範囲なフラットネスを維持したまま、従来を⼤きく上回る⾼NA1.4を実現しました(図2)。

図2. 他の要素を犠牲にしない高NAの実現

図2. UPLXAPO40XOと他社同等品との性能⽐較
 

●フラットネス (Image Flatness : 像平坦性)

視野内での画質の均質度合いを表す指標です。対物レンズは、「球⾯収差やコマ収差によるボケ」、「非点収差によるボケ」、「像⾯湾曲などの収差や周辺減光の影響」により、画像内で画質が不均⼀になる性質があります。視野の周辺でクリアな像が得られない、明るさが視野中⼼と周辺で異なるなど、理想画像と実際の像とのずれを⽰す際に必要な指標です。視野中⼼から周辺までの⾼精細な観察や、視野全域を使った定量解析におけるデータの信頼性を⽰す際には特に重要な指標となります。
オリンパスは、いち早く実際のアプリケーションで求められるフラットネスのレベルを独⾃に定義。sCMOSカメラなどを使った広視野観察においても、NAと⾊収差補正との最適なバランスを設定し、高精細で、且つ視野周辺まで均質な画像取得を実現しました。

PLAPON60XO(従来品)

PLAPON60XO(従来品)

X Line UPLXAPO60XO

X Line UPLXAPO60XO

図3. PLAPON(従来品) とX Line UPLXAPO 対物レンズにおけるフラットネス⽐較
 

●⾊収差補正 (Chromatic Correction)

レンズに使用されるガラス材料は、光の波⻑によって屈折率が異なる性質を持っています。このため、レンズの焦点位置も波⻑毎に異なることになり、これが⾊収差の発生原因となります。顕微鏡観察では正確な画像を得るために⾊収差の補正が⾮常に重要です。従来技術で開発した60倍対物レンズUPLSAPO60XOやPLAPON60XOでは⾊収差補正波⻑域がそれぞれ435〜1,000nmおよび 435〜656nmであるため、UPLSAPO60XOでは短波⻑(<500nm)領域で、PLAPON60XOでは短波⻑(<550nm)および長波⻑(>700nm)領域の両⽅で、徐々に中心波長のフォーカス位置から乖離していました。

新しい60倍対物レンズUPLXAPO60XOでは、NA1.42を保ちながら400〜1,000nmの波⻑域で⾊収差補正を可能としました(図4)。

図4. 400-1,000nmにおけるフォーカス位置(色収差)比較

図4.  400~1,000nmにおけるフォーカス位置(⾊収差)⽐較
 

Conventional PLAPON60XO

PLAPON60XO (従来品)

UPLSAPO60XO(従来品)

UPLSAPO60XO(従来品)

X Line UPLXAPO60XO

X Line UPLXAPO60XO

図4-2.PSF-蛍光ビーズ(405nm, 633nm)での⾊収差⽐較
 

X Lineを実現したオリンパスの優れた製造技術

対物レンズの設計には長年蓄積されたノウハウが重要ですが、さらに重要なのは、その設計を実現する製造技術です。広視野観察と、信頼性の高い演算処理結果を提供するため、オリンパスは独自の研磨技術を開発し、これまで困難であった極薄レンズを実現しました。これにより従来のレンズと比べて光線高の高い光線を利用できるようになり、また同Conventional PLAPON60XOスペース内のレンズ配置の自由度が増すことで、NAを向上しつつ広視野にわたり良好な収差補正、そして色収差補正の波長域を広げることも実現しました。

顕微鏡の対物レンズは、複数の異なる屈折率の凸レンズと凹レンズが組み合わされて、構成されています。また、対物レンズには、その全長に規格があり、一定値(国際標準で、45mmの長さ)内でレンズ群を構成する必要があります。
ここでは、レンズをどのように使用して、X Lineの3要素(高NA、フラットネスの向上、色収差補正波長範囲の拡大)を実現したか、対物レンズを基本形である凸凹凸の3枚のレンズ構成にモデル化して説明します。(図5)
この3枚のレンズで構成された対物レンズの合成焦点距離fは、各レンズの焦点距離と透過する光線の高さを用いて表すと次の式で定義されます。
この合成焦点距離fは対物レンズの倍率によって決まるため、このfは各倍率で一定の値になります。

図5.凸凹凸3枚レンズ構成

図5.凸凹凸3枚レンズ構成
 

合成焦点距離f

fn : 構成する個々のレンズの焦点距離

hn : 構成する個々のレンズでの光線高

nn:構成する個々のレンズの屈折率

●NAの拡大:高分解能・高S/N化

NAの大きな対物レンズを設計するには、標本からの光の取り込み角を大きくする必要があり、h1(図5-2)を大きくする必要があります。さらに、対物レンズの瞳半径はh3=NA×f で表されるため、NAを大きくすると必然的にh3も大きくなります。 h1とh3を大きくするには、凸レンズの有効径を大きくする必要がありますが、対物レンズの全長(45mm)を維持しつつNAを向上させるためには凸レンズのフチ肉(レンズ外周部の厚み)t(図5-2(a))を極薄にする必要があります。(図5-2(b))

(a)従来の凸レンズ

(a)従来の凸レンズ

(b)フチが極薄の凸レンズ

(b)フチが極薄の凸レンズ

 図5-2. 極薄フチ肉凸レンズの効果
 

●フラットネスの向上:視野周辺まで均質で鮮明な観察・画像データの取得

像のフラットネス(平坦性)に影響を与える設計パラメータに、下記の式で表されるペッツバール和 Pがあります。像のフラットネス(平坦性)を良くするためには、このペッツバール和(P)の絶対値を小さくする必要があります。

ペッツバール和

凸レンズの正(+)要素とは、下図のように凸レンズが像の周辺では物体面に近くなるように像面を湾曲させる性質を表すものです。逆に、凹レンズでは、逆向きに像面を湾曲させることができるため、凹レンズは負(-)の要素として働かせることができます。(図5-3)

図5-3.凸レンズおよび凹レンズの像面湾曲

図5-3.凸レンズおよび凹レンズの像面湾曲

図5-3. 凸レンズおよび凹レンズの像面湾曲
 

対物レンズは、全体としては凸レンズの役割を果たすため、Pの正(+)要素が大きくなります。そこで、ペッツバール和 Pの絶対値を小さくしてフラットネスをよくするには、負(-)要素を大きくしなければなりません。(図5-4)

図5-4. ペッツバール和と像面湾曲(フラットネス)補正の関係

図5-4.ペッツバール和と像面湾曲(フラットネス)補正の関係
 

それには、凹レンズの焦点距離f2を小さくする必要がありますが、対物レンズの倍率(合成焦点距離f)とNAを確保するためにh3が一定となるため、f2を小さくする際には、同時にh2も小さくする必要があります。h2を小さくするには、凸レンズと凹レンズの間隔を広げる方法もありますが、前述のように対物レンズの限られたスペースではできないため、凹レンズの中肉(中心部の厚み)dを従来のレンズより薄くする必要があります。中肉を極薄にすることで、凸レンズと凹レンズの間隔が広げられh2を小さくすることができます。(図5-5)

(a)従来の凹レンズ (b)中肉極薄凹レンズ

図5-5.中肉極薄レンズの効果
 

●色収差波長補正範囲の拡大:400-1000nm対応でよりクリアで正確な情報取得

色収差は、ガラスが、光の波長によって屈折率が異なる性質を持っているため、引き起こされる現象です。殆どのガラスは短波長側の屈折率が高くなります。従って、凸レンズでは、短波長の光がレンズに近い側に、長波長の光はレンズから遠い側に集光します。一方、凹レンズは光を発散させるため、長波長側の光よりも短波長の光の方をより発散させます。そこで、凸レンズと凹レンズを組み合わせて、赤と青の焦点位置を合わせることにより色収差を補正することができます。(図5-6)

(a)単レンズの色収差

(a)単レンズの色収差

(b)複合レンズの色収差

(b)複合レンズの色収差

図5-6. 単レンズと複合レンズの色収差比較
 

より広い波長範囲で色収差を補正するには、複数の2枚接合レンズや3枚接合レンズを使用する必要があり、限られたスペースに採用するには、レンズを薄くする必要があります。
次に、対物レンズの設計例を示します。従来設計では7群13枚のレンズで左図の様な性能でしたが、極薄レンズを使用すると、9群15枚のレンズ構成になり、右図の様に性能を大きく向上できます。(図5-7)

(c)従来設計(7群13枚)

(a)従来設計(7群13枚)

(b)極薄レンズを用いた設計(9群15枚)

(b)極薄レンズを用いた設計(9群15枚)

(c)従来設計(7群13枚)

(c)従来設計

(d)

(d)極薄レンズを用いた設計

図5-7.従来設計と極薄レンズ設計の比較
 

以上のように、極薄レンズを使用して対物レンズを設計することにより、対物レンズの全長(国際規格:45mm)を維持し従来の顕微鏡システムと互換性を確保しつつ、高NA、フラットネスの向上、色収差補正波長範囲の拡大の全てを高いレベルで実現したX Lineの開発に成功しました。
 

●波⾯収差コントロールが提供する安定した性能

レンズ性能の向上に伴い、製造⼯程におけるバラツキ(製造誤差)による製品品質の個体差が生じやすくなります。新開発した X LineおよびHR Objectives(図13にて詳細説明)の組み⽴て⼯程では、性能のバラツキを最⼩限に抑えるために波⾯収差コントロールという⽅法で製造管理をしています。対物レンズ個々の波⾯収差を測定し、理想(無収差)の状態に近づけるようにコントロールすることで、従来の対物レンズ(図6-(a))に⽐べて光学性能のバラツキを極めて⼩さく抑え、安定した品質(図6-(b))を実現しています。

(a)  不良な波面

(a)  不良な波面

(b)良好な波面(X Line)

(b)良好な波面(X Line)

図6. 波⾯収差コントロールによる収差ばらつきの軽減
 

X Lineがもたらす⾰新的なイメージング

X Lineが広視野・⾼精細スライドスキャンを実現。

20倍対物レンズUPLXAPO20X(NA0.8)は、従来の同クラスの対物レンズと⽐較してNAが向上し、且つフラットネスも向上しました。そのため、従来品(図7-(a))と⽐べて明るく⾼精細な画像が得られるだけでなく、視野周辺の⾒えを⼤幅に改善しました(図7-(b))。例えばデジタル画像を用いてWSI(Whole Slide Imaging)を⾏う際、像のクオリティ改善だけでなく、貼り合わせ画像の取得効率も向上します。

(a)UPLSAPO20X NA0.75

(a)UPLSAPO20X(NA0.75)

(b)UPLXAPO20X NA0.80

(b)UPLXAPO20X(NA0.80)

図7.従来品(左)とX Line(右)の⽐較画像
 

また蛍光観察時においては、光学性能の向上に伴う励起光の集光効率が向上し、照射する励起光の強度を抑えることが可能となり、蛍光褪⾊や⽣細胞への光毒性が軽減できます。

(a) Conventional UPLSAPO20X

(a)UPLSAPO20X (NA0.75)

(b)X Line UPLXAPO20X (NA 0.80)

(b)UPLXAPO20X (NA0.80)

図8.蛍光観察における従来品(左)とX Line(右)の明るさ⽐較
 

信頼性の⾼いマルチカラー蛍光画像を⾼NAで取得

波長領域400-1000nmでの広範囲な色収差補正により、従来と比べ位置精度の高いマルチカラー蛍光画像を取得することが可能です。これにより、コロカライゼーション解析などにおいて信頼性の高いデータを得ることができます。

placholder image

左:従来の対物レンズ / 右:X Line

図9. 従来の対物レンズとX Line UPLXAPO60XO (NA1.42)とのマルチカラー蛍光画像比較
 

HeLa cell labeled by FISH technique  CEP17(Spectrum Green), CEP18(Spectrum Orange), Nuclear (DAPI) 
従来の対物レンズでは、本来は細胞下部に位置しているシグナルが、細胞の外にあるように見えます。

信頼性の⾼い画像処理・定量解析

画像定量解析において、解析結果はRAWデータの蛍光輝度数値などに影響を受けてしまうため、信頼性の⾼い解析結果を得るためには信頼性の⾼いRAWデータのインプットが重要です。図10は、DAPIで染⾊(励起波⻑︓405nm)し、異なる対物レンズで取得した蛍光画像に、二値化処理を⾏った結果です。従来の⼀般的な対物レンズでは405nmという補正範囲外の波⻑で励起している点、視野周辺においてフラットネスが確保できていない点から取得画像周辺部にある核を正確に認識できていません(図10-(a))。⼀⽅、新開発の60倍対物レンズUPLXAPO60XO(NA1.42)では画像周辺でも核を認識できます(図10-(b))。これは⾊収差(⾊によるフォーカスずれ)だけではなく405nmにおける結像性能も向上できたことによる効果です。

(a)  従来品PLAPON60XO (NA1.42)

(a)  従来品PLAPON60XO (NA1.42)

(b)  X Line UPLXAPO60XO (NA 1.42)

(b)  X Line UPLXAPO60XO(NA 1.42)

図10.405nmにおける⽐較画像(左︓RAWデータ、右︓解析データ)
 

ユーザービリティの高いUPLXAPO40XO NA1.4 対物レンズが実験の効率アップに貢献

従来、細胞内の微細構造を⾼精細に観察する際には、例えば最初に40倍対物レンズを⽤いて視野内の複数細胞の中からサンプル興味部位を特定し、次にNAの⾼い60倍や100倍の対物レンズに切り替えて⾼精細画像を取得するのが撮影までの⼀連の⼯程でした。他方、新開発の40倍対物レンズUPLXAPO40XO(NA1.4)は、40倍の対物レンズでありながら従来の60倍や100倍と同等レベルのNAを実現したため、⼗分な解像と共に撮影視野も60倍より広く、より複数細胞の⾼精細観察に適しています。また対物レンズの切り替えやオイルの追加塗布などの⼿間を省くことができ、対物レンズの切り替えによってサンプル位置がずれたり、⾒失うことがありません。

図11 UPLXAPO40XO (NA1.40)

図11 UPLXAPO40XO (NA1.40)

図11 UPLXAPO40XO (NA1.40)
 

405nm励起を含む⾼解像マルチカラー画像貼り合わせ画像

組織切⽚などの⼤きな標本では画像を貼り合わせて標本の部分または全体像を取得することが⼀般的に⾏われています。貼り合わせを⾏う際に像の平坦性が⼗分確保されていない場合は画像の継ぎ⽬が⽬⽴ってしまう、もしくは均質な画質が得られる領域のみで貼り合わせを⾏うなど、効率を損なう場合がありました。X Lineは広い視野でのフラットネスは勿論、400nmからの⾊収差補正も確保していることから、図12のように405nm励起でも、より精度の高い張り合わせ画像の作成が可能となり、ムラのないクリアで高品質な組織全体像を取得することができ、スループットも向上します。

(a)  従来の対物レンズ

(a)  従来の対物レンズ

(b)  X Line UPLXAPO60XO

(b)  X Line UPLXAPO60XO

図12.  貼り合わせ画像の⽐較(12×12)

Fucci2トランスジェニックマウスの脳切片
FV3000で撮影した12X12の貼り合わせ画像
シアン:DAPI(405nm)
マゼンタ:mCherry (561nm)

標本作成、画像の取得、提供にご協力賜りました先生
理化学研究所 脳神経科学研究センター 細胞機能探索技術研究チーム
小暮貴子先生、宮脇 敦史 先生

 

世界初NA1.5*1、Plan-corrected Apochromat

新研磨技術を開発したことで設計の⾃由度が上がり、NA、フラットネス、⾊収差補正範囲をバランスよく⾼いレベルで実現したのは上述の通りです。オリンパスはさらに、この向上した設計の⾃由度をNAとフラットネスに注⼒することで、世界初のNA1.5を有するPlan-Apochromat対物レンズも実現しました。広視野においても良好なフラットネスと⾼いNAが超解像イメージングやTIRFイメージングに効果を発揮します。

APON60XOTIRF (NA1.49)

APON60XOTIRF (NA1.49)

UPLAPO60XOHR  (NA1.50)

UPLAPO60XOHR (NA1.50)

図13 高解像画像比較

*12018年10⽉4⽇ 一般に使用する液浸油(屈折率ne=1.518)を浸液に用いた対物レンズとして オリンパス調べ。
 

まとめ

進化するデジタル画像処理技術の性能を最⼤限に引き出すには、顕微鏡の光学性能を決定づける最も重要なパーツである対物レンズとの⾼次元での融合が重要です。前述のように、オリンパスの高度な設計技術と新研磨技術をはじめとする独⾃の製造技術をさらに高めることで、これまで困難だった、⾼性能対物レンズX Lineおよび超解像/TIRF⽤⾼解像対物レンズを⽣み出しました。最新のデジタル画像処理技術とオリンパスの光学技術の組み合わせが、信頼性の⾼いデータのハイスループット取得に貢献します。
 

X Line、超解像/TIRF⽤⾼解像対物レンズ一覧

シリーズ名称 対物レンズ名称 NA WD [mm] 色収差補正波長範囲
X Line UPLXAPO4X 0.16 13 400~1000 nm
UPLXAPO10X 0.40 3.1 400~1000 nm
UPLXAPO20X 0.80 0.6 400~1000 nm
UPLXAPO40X 0.95 0.18 400~1000 nm
UPLXAPO40XO 1.40 0.13 400~1000 nm
UPLXAPO60XO 1.42 0.15 400~1000 nm
UPLXAPO100XO 1.45 0.13 400~1000 nm
UPLXAPO60XOPH 1.42 0.15 400~1000 nm
UPLXAPO100XOPH 1.45 0.13 400~1000 nm
HR(超解像/TIRF⽤⾼解像対物レンズ) UPLAPO60XOHR 1.50 0.11 435~656 nm
UPLAPO100XOHR 1.50 0.12 435~656 nm

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著者
オリンパス株式会社 技術開発部門 光学システム開発本部
坂倉 正洋

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