부착 단세포의 선택적 고립

Sandra Lubos^1,2, Nils Körber¹, Heide Marie Resch¹, Iris Augustin², Stefan Niehren^1
1독일 Eching, Molecular Machines & Industries GmbH
²독일 Weihenstephan-Triesdorf University of Applied Sciences
2017년 11월 15일

적요

단세포의 격리는 병리학, 종양학, 포렌식스에서 많은 연구 프로젝트의 필수 전제 조건입니다.
MMI CellEctor는 현탁 단세포의 선택적 격리를 촉진하도록 설계되어 있습니다. 본 연구에서는 부착 세포의 효율적 흡수를 위한 새로운 “Shake Mode” 기능의 개발을 예시합니다. 부착 세포의 부드러운 분리를 촉진하기 위해 이 고유 모듈을 MMI CellTools 소프트웨어에 통합하였습니다. 따라서 Shake Mode를 통해 살아있는 부착 세포뿐 아니라 현탁 세포의 효율적 이식이 가능합니다.

그림 1: Olympus IX83 도립현미경의 MMI CellEctor 시스템. 이 시스템에는 조직 내 세포를 고립시키기 위해 MMI CellCut 레이저 현미해부 시스템도 장착되어 있습니다.

서론

벌크 분석 수행보다는 단세포 연구가 중요한 여러 이유가 있습니다. 종양학에서는 전이 중인 또는 순환성 종양 세포(CTC) 내 종양 억제 유전자 또는 종양 유전자의 다양한 돌연변이의 식별이 추구되는데, 그 이유는 이러한 부종양종이 환자의 생존에 기여하는 주요인이며 일차 종양과 다르게 치료에 반응할 수 있기 때문입니다. 포렌식스에서는 범죄 현장에서 샘플을 피해자와 가해자에게 할당하기 위해 DNA 프로필을 연구합니다. 
세포 집단의 DNA가 동일할 수 있더라도 발현 프로필에서 개별 세포는 종종 다릅니다. 따라서 많은 연구원들은 시간, 스트레스, 독소, 성장 인자 등 다른 조건 하에서 또는 다른 조직 내 세포의 RNA 및 단백질 레벨에 관심이 있습니다.
조직 부분 및 현탁 세포에 대해 단세포를 격리하기 위한 여러 방법들이 개발되었습니다. 하지만 이러한 방법들의 대부분은 개별 세포를 선택하는 능력, 즉 예를 들어 형광 활성화 세포 선별(FACS)이 결여되어 있습니다. MMI CellEctor는 용액 내 단세포를 선택적으로 격리하는 데 입증된 도구입니다^1-7. 이 도구는 현미경과 소프트웨어 제어 미세 모세관에 연결된 펌프로 구성되어 있습니다. 이를 통해 연구원들은 단세포를 광학적으로 선택한 다음 정의된 부피로 미세 모세관으로 흡수할 수 있습니다. 세포 흡인 및 투여에 필요한 힘을 생성하기 위해 펌프 부피를 조정할 수 있습니다. 하지만 부착력이 분리와 흡수를 막기 때문에 살아있는 부착 세포를 흡인하는 것은 어려운 일이었습니다.
살아있는 부착 세포는 일반적으로 트립신처리로 분리될 수 있지만 이러한 처리로 인해 세포의 RNA 및 단백질 발현 프로필이 변경되어 전사체학 또는 단백질체학 데이터가 부정확하게 될 수 있습니다.
이 애플리케이션 노트에서는 단일 부착 세포의 격리를 위한 최적 조건을 수립하고 트립신처리를 피하며 격리된 세포가 추가 배양 및 다운스트림 분석을 위해 생존해 있는지 확인합니다. 추가 세포로 오염 없이 선택적으로 민감하게 하나의 세포를 흡인하기 위해 매개변수를 조정하고 시험하였으며 이 세포를 효과적으로 침적시켰습니다.

재료 및 방법

37°C(98.6°F) 및 10% CO₂에서 FBS, 비필수 아미노산, L-Glutamin 및 Penicillin-Streptomycin으로 보충된 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)에 HeLa 세포를 배양하였습니다. 300μl의 세포 현탁액(1 × 10⁴ 세포/ml)을 8웰 슬라이드(유리 바닥 또는 처리된 폴리에틸렌, ibidi)로 이식하여 하룻밤 동안 배양하였습니다.
Olympus IX83 도립현미경에 장착된 MMI CellEctor를 사용하여 단세포들을 선택하고 흡인하여 침적시켰습니다. MMI CellEctor에는 세포 배지로 사전 충전된 80µm 모세관이 장착되어 있습니다. 10단계의 세포 획득 및 침적 후 MMI Capillary Clean 및 세포 배지를 사용하여 모세관을 씻어냈습니다. 300µl 세포 배지로 처리되고 37°C(98.6°F), 10% CO₂에서 사전 배양된 두 번째 8웰 슬라이드에서 선택된 웰 안에 세포를 침적시켰습니다. 

결과

단일 HeLa 세포의 선택적 격리와 이들 세포를 별도 슬라이드로 이식하기 위한 최적 조건을 확인하기 위해 펌프 부피 및 속도, 유지 시간 및 미세 모세관 각도 같은 각기 다른 매개변수에 차이를 주었습니다. 하지만 펌프에서 생성된 유동력이 부착 세포를 분리하기에 충분하지 않은 것으로 드러났습니다. MMI CellTools 소프트웨어를 사용하여 현미경 스테이지를 정밀하게 움직일 수 있기 때문에 스테이지를 약간 회전시켜 모세관 벽 쪽으로 선택한 세포를 밀었습니다(그림 2).

그림 2: Shake Mode의 도식 표현.

이러한 약간의 변형력은 세포를 분리하기에 충분하였으며 미세 모세관에 의한 후속적인 흡인을 가능하게 하였습니다. 이를 통해 MMI CellTools 패키지 내의 새로운 소프트웨어 기능으로서 Shake Mode의 개발이 초래되었습니다. 사용자는 회전 치수(회전 중심에서 x 거리와 y 거리로 정의됨), 회전 속도 및 반복 횟수를 최적화하도록 Shake Mode를 사용자 지정할 수 있습니다. 이 예에서는 반경 60µm(x = y = 60µm) 및 100µm/s 속도와 2회 반복으로 Shake Mode를 적용하였습니다. 이 조건으로 효과적인 HeLa cell 분리와 성공적인 흡인이 이루어졌습니다(그림 3).

그림 3: Shake Mode 적용 및 미적용 상태의 HeLa 세포 증가율. Shake Mode를 사용하여 70% 이상의 성공률로 부착 단세포를 흡인할 수 있습니다. 동일한 조건으로 하되 Shake Mode를 적용하지 않는 경우 세포를 전혀 흡인할 수 없습니다.

Shake Mode를 적용한 후 50nl의 흡인 부피와 60nl의 침적 부피(둘 다 6nl/s)에서 효과적이고 재현가능한 세포 이식 조건이 충족되는 것을 확인하였습니다. 모세관 각도를 90°로 조정하였습니다. 또한 각 세포 침적 주기 후 3초 동안 모세관이 유지되도록 하였습니다. 단세포 흡인 및 침적의 일반적 주기는 그림 4에 나타나 있습니다.

그림 4: MMI CellEctor를 사용하여 HeLa 세포^*를 선택적으로 고립시킬 수 있습니다. A) 미세 모세관으로 단세포를 선택하고 접촉합니다. B) Shake Mode를 사용하여 현미경 스테이지를 회전시켜 세포를 미세 모세관 쪽으로 밀면 세포가 세포 챔버에서 분리됩니다. 그런 다음 세포를 선택적으로 흡인할 수 있습니다. C) 흡인된 세포는 주위 세포에 영향을 미치지 않습니다. D) 세포가 대상 웰에 침적됩니다. 동영상을 확인하거나 아래 QR 코드를 스캔합니다.

이식 절차가 매우 부드러우므로 HeLa 세포가 생명을 유지할 수 있습니다. 새 세포 배양 접시로 이식된 후 세포가 성장하고 분할하여 새 배양의 기반을 형성할 수 있습니다(그림 5) ⁹.

그림 5: MMI CellEctor를 사용한 이식 (a) 1일, (b) 2일 및 (c) 5일 후 세포 배양에서의 HeLa 세포^*.

논의

본 연구에서는 새로운 MMI CellTools Shake Mode 소프트웨어 기능을 적용할 경우 원치 않는 추가적 세포의 흡인 없이 미세 모세관으로 단세포를 흡수하는 것이 입증되었습니다. 또한 목표 위치에서 흡인된 세포를 효율적으로 방출하도록 조건을 최적화하였습니다.
세포들이 부착, 크기 및 모양 등 다른 속성을 가질 수 있기 때문에 각기 다른 세포 유형에 대해 프로토콜을 약간 조정해야 할 수 있습니다. 하지만 후속적인 미세 조정을 위한 출발점으로 위에 설명된 매개변수를 적용할 수 있습니다
본 연구를 통해 세포의 생존율이나 완전한 상태에 영향을 미치지 않고 새로운 Shake Mode를 사용하여 부착 세포를 표면에서 분리할 수 있음이 밝혀졌습니다. 따라서 이제 다운스트림 적용을 위해 그리고 민감한 RNA 발현 분석을 위해서도 단세포를 선택적으로 격리하고 활용할 수 있습니다.
애플리케이션 노트는 Molecular Machines and Industries의 허가를 얻어 게시하였습니다.

참고문헌

1. Pizon, M. et al. Heterogeneity of circulating epithelial tumour cells from individual patients with respect to expression profiles and clonal growth (sphere formation) in breast cancer. Ecancermedicalscience 7, (2013).
2. Zimon, D., Pizon, M., Stein, E.-L., Pachmann, U. A. & Pachmann, K. Vemurafenib to eliminate BRAF-mutated circulating epithelial tumor cells (CETCs) from blood of patients with malignant melanoma. J. Clin. Oncol. 33, 11031 (2015).
3. Hjortland, G. O. et al. Genome wide single cell analysis of chemotherapy resistant metastatic cells in a case of gastroesophageal adenocarcinoma. BMC Cancer 11, 455 (2011).
4. Lapin, M. et al. MINDEC-An Enhanced Negative Depletion Strategy for Circulating Tumour Cell Enrichment. Scientific Reports 6, 28929 (2016).
5. Lapin, M. et al. Single-cell mRNA profiling reveals transcriptional heterogeneity among pancreatic circulating tumour cells. BMC Cancer 17, 390 (2017).
6. Alberter, B., Klein, C. A. & Polzer, B. Single-cell analysis of CTCs with diagnostic precision: opportunities and challenges for personalized medicine. Expert Rev. Mol. Diagn. 16, 25–38 (2016).
7. Sukhbaatar, N. et al. Two different, mutually exclusively distributed, TP53 mutations in ovarian and peritoneal tumor tissues of a serous ovarian cancer patient: indicative for tumor origin? Mol. Case Stud. (2017). doi:10.1101/mcs.a001461
8. Huang, H.-L. et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, 36 (2010).
9. Lubos, S. Verfahrensoptimierung der kapillarbasierten Einzelzellisolation von lebenden adhärenten Zellen. (Hochschule Weihenstephan-Triesdorf, 2017).

* 비록 헬라 세포가 의료 연구에서 가장 중요한 세포주가 되었다고 해도, 과학에 대한 Henrietta Lacks의 공헌이 동의를 받지 않은 것이었다는 것을 인정해야만 합니다. 이로 인해 면역학, 전염병, 암에 대한 중요한 발견이 이루어졌지만 사생활, 윤리, 의학적 동의에 대한 중요한 논의도 촉발되었습니다.
Henrietta Lacks의 삶과 현대 의학에 대한 그녀의 공헌을 알아보려면 여기를 클릭하세요.
http://henriettalacksfoundation.org/