CM20 배양 모니터링 시스템으로 매우 정확하고 쉽게 세포 증식 및 세포 독성 측정하기

서문

세포 증식/세포 독성 분석은 배양 세포와 관련된 연구에서 가장 자주 사용되는 검사 중 하나입니다. 이는 치료에 사용되는 약물의 농도를 조사하기 위한 필수 예비 검사이며, 종양학과 세포 사멸과 같은 다양한 연구 분야에서 약물의 유효성과 안전성을 판단하는 데 매우 중요한 검사입니다.

기존에는 대사활성도가 지표인 WST-8 또는 ATP 분석, DNA 합성 수준이 지표인 BrdU 또는 티미딘 분석을 사용하여 세포의 성장 특성을 정량적으로 평가했습니다. 이러한 분석은 단순성과 처리량 덕분에 유용하지만, 모두 간접 평가 방법이기 때문에 결과가 실제 세포 수와 관계없을 수 있습니다. 종점 평가일 때가 많기 때문에, 때로는 시간에 따른 변화를 포착하지 못하여 중요한 결과를 놓치게 됩니다.

이러한 한계가 있기 때문에, 우리는 배양 세포를 사용하는 연구 분야에서 세포 증식/세포 독성의 시간에 따른 직접적 평가 방법을 개발하는 것이 중요하다고 생각합니다.

실험 개요

OLYMPUS Provi CM20 배양 모니터링 시스템의 세포 증식/독성 평가 능력을 확인하기 위해, 다음 두 가지 분석을 통해 CM20 시스템을 기존 분석(WST-8)과 비교했습니다.

• 인간 폐 선암종 A549 세포에서 항암제(5-FU)를 사용한 세포 사멸 분석
• 인간 신경 아세포종 SH-SY5Y 세포에서 신경독(6-OHDA)을 사용한 세포 사멸 분석

실험 절차

항암제(5-FU)를 사용한 암세포 사멸 분석

인간 폐 선암종 A549 세포를 멀티웰 플레이트에 시딩하고, 시딩 24시간 후 시점부터 72시간 동안 5-FU(400 μM)로 치료하고, CM20 시스템으로 세포 수를 매시간 영상 촬영 및 측정했습니다. 치료용 5-FU의 농도는 세포 증식과 세포 사멸이 평형을 이루도록 설정했고, 5-FU 미치료군을 대조군으로 두었습니다. WST-8 분석을 사용하여 치료를 시작한 지 0, 24, 48, 72시간 후에 기존 방법을 사용하여 세포 생존력을 측정했습니다.

신경독(6-OHDA)을 사용한 세포 사멸 분석

인간 신경 아세포종 SH-SY5Y 세포를 멀티웰 플레이트에 시딩하고, 시딩 24시간 후 시점부터 24시간 동안 6-OHDA(60 μM)로 치료하고, CM20 시스템으로 세포 수를 매시간 영상 촬영 및 측정했습니다. 치료용 6-OHDA 농도는 세포 사멸을 빠르게 유도하도록 설정했고, 6-OHDA 미치료군을 대조군으로 두었습니다. WST-8 분석을 사용하여 치료를 시작한 지 0, 6, 12, 24시간 후에 기존 방법으로 세포 생존력을 측정했습니다.

결과

항암제(5-FU)와 A549 세포를 사용한 암세포 사멸 분석

그림 1. 5-FU로 치료한 A549 세포의 이미지.
상단 행: 5-FU 미치료군. 하단 행: 400μM 5-FU 치료군.

5-FU 미치료군에서는 배양 지속에 따라 세포 수가 증가했고, 치료 시작 후 72시간쯤에 세포가 100% 밀집되는 것을 관찰했습니다. 5-FU 치료군에서는 치료 시작 후 24시간이 지난 후 세포 밀도의 큰 변화 없이 치료 지속에 따라 사멸 세포 수가 증가했습니다.

그림 2. A549 세포 생존력의 정량 측정.
왼쪽: CM20으로 측정한 세포 수. 오른쪽: 기존 분석(WST-8) 방법으로 측정한 세포 수.

CM20 시스템으로 분석한 결과, 5-FU 미치료군에서는 시그모이드 곡선 형태로 세포 수가 증가했으나 5-FU 치료군에서는 치료 시작 24시간 후에 세포 수에 큰 변화가 없었으며 이는 세포 증식과 세포 사멸이 평형을 이룸을 나타냅니다. 이러한 결과는 육안으로 세포를 관찰한 결과와 일치합니다. 또한 기존 방법(WST-8 분석)으로 얻은 결과와도 일치합니다.

신경독(6-OHDA)과 SH-SY5Y 세포를 사용한 암세포 사멸 분석

그림 3. 6-OHDA로 치료한 SH-SY5Y 세포의 이미지.
상단 행: 6-OHDA 미치료군. 하단 행: 60μM 6-OHDA 치료군.

6-OHDA 미치료군에서는 24시간 시점에 약간의 세포 수 증가를 관찰했습니다. 6-OHDA 치료군에서는 치료 6시간 후 시점에 세포 수 감소를 관찰했고, 치료 시작 12시간 후 시점에는 대부분의 세포가 사멸된 것을 관찰했습니다.

그림 4. SH-SY5Y 세포 생존력의 정량 측정.
왼쪽: CM20 시스템으로 측정한 세포 수. 오른쪽: 기존 분석(WST-8) 방법으로 측정한 세포 수.

CM20 시스템을 사용한 분석 결과, 6-OHDA 미치료군에서 치료 24시간 후 시점에 세포 수가 약간 증가한 반면, 6-OHDA 치료군에서는 치료 3시간 후 시점에 세포 수가 감소하기 시작하여 이후 감소가 계속되는 것으로 나타났습니다. 치료 12시간 후 시점에는 세포 수에 큰 변화가 보이지 않았으며, 이는 치료 시작 후 약 12시간 이내에 거의 모든 세포가 사멸되었음을 의미합니다. 이러한 결과는 육안으로 세포를 관찰한 결과와 일치합니다. 또한 기존 방법(WST-8 분석)을 사용한 결과와도 일치합니다.

CM20 시스템으로 얻은 결과와 기존 분석으로 얻은 결과에 대한 논의

CM20 모니터링 시스템을 사용하여 암세포에 대한 항암제 작용과 신경계 세포에 대한 다른 약물의 신경독성을 분석한 결과는 이미지 관찰과 기존 방법(WST-8 분석)에서 얻은 결과와 거의 동일했습니다.

CM20 배양 모니터링 시스템을 사용한 평가의 이점

평가에 CM20 시스템을 사용했을 때의 이점 중 하나는 샘플링 간격이 짧아 사용자가 시간 에 따른 세부 사항을 확인할 수 있다는 것입니다. 예를 들어, SH-SY5Y 세포를 사용한 검사에서는 거의 모든 세포가 6-OHDA 치료 후 약 12시간 시점에 사멸했습니다. 반면, 종점 분석에서는 그러한 정보를 제공하지 않습니다.

CM20 시스템의 또 다른 이점은 시간 경과 데이터를 플레이트 하나만으로 얻을 수 있다는 것입니다. 기존 방법에서는 측정 시점마다 플레이트를 준비해야 하므로 시점이 많아질수록 작업량이 증가하고 분석할 수 있는 플레이트 수가 한정됩니다. 그리고 기존 분석 방법을 사용할 때 측정 지점이 증가하면 데이터 분석의 복잡성도 함께 증가하는 반면, CM20 시스템에서는 다지점 관찰과 결과 그래프의 출력이 자동으로 가능합니다.

CM20 시스템의 또 다른 이점은 자동 이미지 획득 기능이 있어 데이터 분석 단계가 시작된 후에도 사용자가 세포 증식과 형태 변화의 상태를 검토할 수 있다는 것입니다. CM20 시스템에서는 분석 과정 전반에서 세포 이미지를 기록하므로 잠재적으로 중요한 정보를 더 많이 수집하고 분석할 수 있습니다. 기존 방법으로는 여러 지점을 분석한 후 재검사하여 적절한 치료 기간을 추정해야 하는 경우에도, CM20 시스템으로 분석하면 나중에 한 번의 검사로 적절한 치료 기간을 결정하고 그 기간 내에 데이터를 추출할 수 있습니다.

Yamaguchi 박사의 견해

우선, CM20 배양 모니터링 시스템을 사용했을 때의 세포 수의 정확성에 깊은 인상을 받았습니다. CM20 시스템은 인식한 세포를 모니터에 하나씩 따로 표시했습니다. 이 분석을 사용하면 초기 매개변수가 적절히 설정되었을 때 재현성이 높은 정량적 평가가 가능함을 확인했습니다.

기존의 간접 세포 수 측정 방식과 달리, CM20 시스템에서는 표지가 필요하지 않습니다. 표지는 세포에 영향을 미칠 수 있으므로 이 절차를 피하는 CM20 시스템은 세포 수 평가에서 신뢰할 수 있는 분석 방법이 됩니다. 또한 CM20 시스템의 매력은 하나의 플레이트에서 여러 시점의 데이터를 거의 자동으로 획득할 수 있어 작업량이 크게 줄어들고 중요한 데이터를 간과하는 위험을 없앨 수 있다는 것입니다.

실험에 사용된 약물의 종류와 농도에 따라, 가령 세포가 모두 사멸하거나 밀집에 도달하여 종점에서 차이가 관찰되지 않는다고 해도 치료 중간에 약간의 변동이 관찰될 수 있습니다. 이러한 경우, CM20 시스템을 사용하면 치료 기간을 추정하는 데 필요한 시간과 노력을 크게 줄여 연구 효율성과 속도를 높일 수 있다고 생각합니다.

감사의 글

이 애플리케이션 노트는 다음 연구원의 도움을 받아 작성되었습니다.
Takahiro Yamaguchi, PhD, ACEL, Inc.의 수석 연구원