FV3000RS 공초점 현미경을 사용한 동적 용적 측정 이미징: 콜레토트리쿰 그라미니콜라 포자에서 액틴 동역학의 3D 복원

콜레토트리쿰 그라미니콜라는 널리 퍼진 균질 병원균이자 밀과 옥수수를 포함한 곡물의 질병을 유발하는 주요 매개물입니다. 옥수수에서 C. 그라미니콜라의 진균 감염은 탄저 엽고병을 유발하여 심각한 작물 피해와 농촌의 커다란 경제적 손실을 초래합니다. 따라서 C. 그라미니콜라 포자 발아에서 세포골격 동역학을 이해하면 질병 예방에 도움이 될 수 있습니다.

발아 전 실 모양의 액틴 케이블의 준비

이 실험에서는 발아 전 C. 그라미니콜라 포자의 액틴 동역학을 연구하기 위해 FLUOVIEW FV3000RS 현미경을 사용하였습니다. 아직 발아하지 않은 초승달 모양의 포자 내에 실 모양의 액틴 케이블을 관찰할 수 있습니다. 이 케이블은 표면과의 접촉면에서 포자 전체에 걸쳐 세로로 연장되도록 준비되었습니다 액틴 케이블이 중앙에서 포자의 양단 쪽으로 수축되는 것을 볼 수 있습니다.

그림 1: 발아 전 C. 그라미니콜라 포자의 액틴 동역학의 XYZT 복원.

이미징 조건
대물렌즈: 100X 오일 1.49NA TIRF 대물렌즈(UAPON100XOTIRF)
현미경: FLUOVIEW FV3000RS 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경
레이저: 488nm(GFP, 녹색), 561nm(DIC, 회색)
스캐너: 공진 스캐너
XY 프레임: 0.272초/프레임
Z 계열: 22스텝(6초/섹션)
T 계열: 3분 동안 30 Z 스택 획득됨

발아 중 두 개의 별개 세포골격의 관찰

액틴 케이블의 준비 후 연속적인 두 세포골격 이벤트 중에 패치와 케이블이 형성되면서 두 이벤트에 의해 C. 그라미니콜라 포자의 발아 과정이 표시됩니다. 첫 번째 이벤트에서 세포골격은 진균 포자를 두 개의 별개 세포(포자의 폭 전체에 걸쳐 내측 장벽에 의해 묘사됨)로 묘사하는 중격을 형성하도록 재배열됩니다 중격 형성 이벤트 후 발아 위치에서 액틴 케이블이 형성되고 정점을 향해 개발 발아관으로 연장됩니다. 그림 2 및 3에서 이러한 두 이벤트를 확인할 수 있습니다.

그림 2: C. 그라미니콜라 포자의 발아에서 중격 형성 이벤트 중 횡벽(cross-wall) 형성의 XYZT, 발아관 형성이 이어짐.

이미징 조건
대물렌즈: 100X 오일 1.49NA TIRF 대물렌즈(UAPON100XOTIRF)
현미경: FLUOVIEW FV3000RS 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경
레이저: 488nm(GFP, 녹색), 561nm(DIC, 회색)
스캐너: 공진 스캐너
XY 프레임: 0.470초/프레임
Z 계열: 31스텝(5.35초/스택)
T 계열: 33분 동안 1분 간격으로 34 Z 스택 획득됨

그림 3: 개발 발아관을 분명히 확인할 수 있는 C. 그라미니콜라 포자의 액틴 세포골격의 3D 복원

이미징 조건
대물렌즈: 100X 오일 1.49NA TIRF 대물렌즈(UAPON100XOTIRF)
현미경: FLUOVIEW FV3000RS 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경
레이저: 488nm(GFP, 녹색), 561nm(DIC, 회색)
스캐너: 직류 전기 스캐너
Z 섹션: 17스텝

FV3000 컨포칼 현미경에 의한 실험 촉진 방법

Olympus의 TruFocus Z-드리프트 보상 시스템으로 4D 타임 랩스 중 초점 유지

첨단 TruFocus Z-드리프트 보상 시스템(ZDC)을 사용하여 Z 차원 영역에 편차가 없는 다중 순차 Z 스택을 획득할 수 있습니다. 이를 통해 입체적으로 명료하게 집중적이고 연속적인 타임 랩스이 가능하므로 연구원은 Z 편차에 대한 염려 없이 전체 샘플에서 단백질 동역학 정보를 얻을 수 있습니다.

공진 스캐너로 신속한 4D 획득

FV3000RS 현미경은 라이브 셀 동역학의 신속한 타임 랩스 획득이 가능한 고성능 공진 스캐너가 특징입니다. 또한 FV3000RS 현미경의 공진 스캐너는 512 × 512픽셀에서 초당 30프레임의 이미징 속도로 전체 1X 시야(FN 18)를 유지합니다. 연구원은 공진 스캐너를 사용하여 몇 초 이내에 다중 평면의 Z 스택을 획득하고 라이브 셀 내 신속한 발현 현상의 고해상도 Z 스택을 얻을 수 있습니다.

라이브 셀 이미징을 위한 고감도를 제공하는 TruSpectral GaAsP 검출기

모든 FV3000 컨포칼 현미경에 통합된 TruSpectral 검출 기술을 통해 기존 스펙트럼 검출 장치보다 더 높은 빛 처리량을 제공합니다. VPH(Volume-Phase Holographic) 분광 장치는 기존의 반사 회절 격자에 비해 최대 3배 더 높은 전달 효율로 빛을 회절시킵니다. 고효율 GaAsP PMT와 결합 시 FV3000 현미경의 고감도 스펙트럼 검출기(HSD)는 높은 신호 대 잡음 이미지를 얻기 위해 최소 레이저 파워를 필요로 하며, 강력하지만 부드러운 라이브 셀 이미징을 제공할 수 있습니다.

Joseph Vasselli와 Dr. Brian Shaw의 견해

우리 연구의 목적은 사상균 내 성장 및 발육에서 세포골격 및 식작용 단백질의 역할을 이해하는 것입니다. 성장 극성의 변이 중 이러한 단백질의 시공간적 편재화 추적이 실험에 결정적입니다. FV3000 현미경의 최고의 Z-드리프트보상, 고감도 검출기 및 고속 공진 스캐너를 통해 고해상도 XYZT를 획득하여 라이브 셀 내 이러한 단백질의 동역학 정보를 효과적으로 얻을 수 있습니다.

감사의 말

이 애플리케이션 노트는 다음 연구원들의 도움으로 작성되었습니다.