Olympus FLUOVIEW FV3000 및 TruFocus Z-Drift 보정 시스템을 사용한 세포 운동성 및 증식의 연장된 타임랩스 이미징

세포 배양 기반의 이미징 분석은 다양한 생물학적 현상을 조사하기 위한 기초 단계입니다. 연구진은 이러한 기법을 사용하여 시간에 따른 세포의 증식과 활동을 관찰할 수 있습니다. 세포 개체군은 운동성의 다양한 단백질 발현 프로파일과 패턴을 국지적으로 나타낼 수 있으므로, 이미징 분석을 신중하게 설계하여 불충분한 샘플링으로 인해 야기되는 편향과 왜곡된 결과를 방지해야 합니다. 따라서 세포 배양 기반의 이미징 실험은 마이크로플레이트 웰 또는 배양 장치 전반에 걸쳐 여러 시야를 수용하도록 설계해야 합니다. 이 애플리케이션 노트에서는 단일 실험에서 철저하고 확실한 데이터셋을 얻기 위해 FV3000 현미경이 어떤 방식으로 복잡한 수집 매개변수를 통해 다영역 타임랩스 이미지를 캡처할 수 있는지 알아봅니다.

단일 실험의 다중 시야 캡처

이 실험에서는 FV3000 컨포칼 현미경의 다영역 타임랩스(MATL) 모듈을 사용하여 세포질 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 인체 탯줄 정맥 내피세포(HUVEC) 개체군의 운동성과 증식을 12.5시간 동안 연속으로 모니터링 했습니다. 여러 영역을 다양한 배율 및 Z-stack 매개변수로 모니터링하여 개별 세포의 역학을 추적하는 것은 물론, 개체군의 활동을 온전하게 추적하는 것은 실험 설계 과정에서 중요했습니다. MATL 모듈을 사용하면 각 위치 또는 타일화된 영역에 대해 독립적인 XYZT 매개변수를 등록할 수 있으므로, 시간이 경과함에 따른 배율 및 Z-stack 매개변수가 다른 여러 영역에 대한 다양한 이미징 조건을 프로그래밍하고 설정하기 쉬웠습니다.

_{그림 1. 다영역 타임랩스 실험 도식. 웰 플레이트의 각 웰에 대해 개별 영역 및 타일 영역의 여러 위치가 다양한 독립 배율과 Z-stack 매개변수로 프로그래밍 되었습니다. 이렇게 등록된 위치는 12시간 25분간의 사이클 동안 이미징 되었습니다.}

위치별 자동 초점을 사용한 HUVEC 세포 운동성 및 증식 추적

시간이 경과함에 따라 여러 영역을 이미징 할 때 가장 어려운 점 중 하나는 현미경실 환경의 작은 온도 변화로 인해 초점이 서서히 움직이는 경향이 있다는 점입니다. 또한 커버슬립 표면과 샘플 조직 사이의 거리는 표면적에 따라 달라질 수 있으므로, 다중 시야의 선명한 이미지를 얻기가 더욱 어려워집니다. TruFocus Z-drift 보정 시스템은 비광독성 근적외선 레이저를 이용하여 커버슬립과 샘플 간 접점의 위치를 찾아내고 해당하는 초점 위치를 결정하여 이러한 문제를 방지합니다. TruFocus 시스템과 MATL 기능을 조합하여 여러 개의 독립된 XYZT 위치를 위치별 자동 초점에 간단히 등록할 수 있습니다.

이 실험에서는 배율 및 Z-stack 매개변수가 다른 여러 영역에 시간에 따른 사이클을 설정하여 개별 세포 수준 및 개체군 전체 레벨 모두에서 HUVEC의 운동성과 증식의 변화를 추적했습니다. 그림 2의 비디오 하이라이트에 나와있듯이, MATL과 TruFocus 시스템을 조합하여 12시간의 실험 동안 또렷한 초점을 유지하면서 여러 웰의 반복적인 이미징이 가능했습니다.

_{그림 2. 세포질 GFP를 발현하는 HUVEC의 XYZT 다영역 타임랩스. 화면에 나온 것은 다양한 수집 매개변수를 사용한 서로 다른 위치의 4가지 샘플 이미지입니다. TruFocus 시스템은 13시간 실험 동안 다양한 시야에서 샘플에 초점을 유지하기 위해 사용되었습니다.}

이미징 조건

상단 패널 2개:
대물렌즈 UPLXAPO20X
현미경: FLUOVIEW FV3000RS 레이저 스캔 컨포칼 현미경
레이저: 488nm(GFP, 녹색)
스캐너: 공진(Resonant)
Z 시리즈: 16스텝
스캔한 총 영역 수: 14

하단 패널 2개:
대물렌즈 UPLXAPO10X
현미경: FLUOVIEW FV3000RS 레이저 스캔 컨포칼 현미경
레이저: 488nm(GFP, 녹색)
스캐너: 공진(Resonant)
Z 시리즈: 15스텝
스캔한 총 영역 수: 48

총 실험 시간: 13시간 11분

FV3000 컨포칼 현미경으로 실험을 지원한 방식

Olympus TruFocus Z-Drift 보정 시스템으로 다영역 타임랩스 동안 초점 유지

TruFocus Z-drift 보정(ZDC) 시스템은 장시간의 타임랩스 실험 동안 샘플에 또렷한 초점을 유지할 수 있도록 초점 드리프트를 방지하는 완전한 전동 모듈입니다. TruFocus 시스템은 유리 및 플라스틱 바닥 디시(dish)를 포함한 여러 가지 대물렌즈 및 베슬(vessel) 유형을 지원하여 애플리케이션 기능을 향상시킵니다. 이로 인해 사용자는 Z-drift에 대한 우려 없이 다양한 이미징 조건에서 또렷하고 초점을 잃지 않은 연속 타임랩스 데이터를 생성할 수 있습니다.

다영역 타임랩스(MATL) 소프트웨어 모듈을 사용하여 독립된 XYZT 매개변수 지원 다영역 타임랩스(MATL) 소프트웨어 모듈은 FV3000 현미경의 모터라이징 XY 스테이지를 제어하여 각각의 등록된 위치 또는 타일 영역에 독립된 XYZT 매개변수를 허용합니다. MATL 모듈은 FV3000 도립 현미경에서 제공하는 하드웨어 완전 통합 및 정밀한 타이밍을 통해 확실하고 정확한 타임랩스 데이터를 제공합니다. 따라서 다양한 상용 커버글라스 바닥 배양접시는 물론, 맞춤형 장치 및 마이크로플레이트까지도 이미징에 적합하게끔 시스템을 설정할 수 있습니다.

James Hoying 박사의 의견 우리는 멀티 웰 플레이트에 들어있는 많은 웰에 배열된 다양한 3D 혈관 조직 모델을 다루는 일을 합니다. 3D 혈관 구조의 고해상도 컨포칼 이미지를 사용하여 한 번에 수십 가지 조직에서 혈관분포 및 혈관 형태학을 측정해야 할 때가 많아서, TruFocus 시스템과 FV3000 현미경의 MATL 기능은 매우 중요합니다.

감사의 글

이 애플리케이션 노트는 다음 연구원의 도움을 받아 작성되었습니다.

James Hoying 박사 - Advanced Solutions Life Sciences, 수석 과학관