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애플리케이션 노트

새로운 Fucci(CA) 응용 개발: 세포 주기 시각화를 위한 형광 프로브


Fucci(형광 유비퀴틴화 기반 세포 주기 지표)는 살아있는 세포 주기 모니터링을 위한 두 개의 형광 센서의 유전적으로 암호화된 세트입니다. 2017년에 새로 개발된 Fucci(CA)는 세포 주기 의존적 방식으로 mCherry(빨간색) 또는 mVenus(파란색)으로 핵을 표지합니다.  Fucci(CA)는 G1 위상의 종료 시 빨간색 형광이 갑자기 감소되면 G1 위상 전체에 걸쳐 mCherry의 풍부한 발현을 산출합니다. Fucci(CA)를 사용하여 짧은 G1 위상을 확실하게 검출하고 S 및 G2 위상을 구별할 수 있습니다. 이전에는 이러한 기능을 달성하기 어려웠습니다.

Fucci(SA)

Fucci(SA)

Fucci(CA)

Fucci(CA)

그림1: Fucci(SA) 및 Fucci(CA)에 의한 세포 주기 진행의 시각화

낮은 광독성, 미분화 ES 세포의 타임 랩스 이미지 획득

미분화 배아 줄기(ES) 세포는 빠르게 증식하며 매우 섬세합니다. 타임 랩스 촬영 이미징 수행 중 광독성이 ES 세포를 손상시키고 증식 속도를 감소시킬 수 있으며, 이로 인해 생리학적으로 정확한 조건에서 ES 세포의 타임 랩스 이미징을 수행하기 어려울 수 있습니다. FV3000 현미경은 매우 효율적인 광경로 및 고감도 검출 장치로 인해 매우 낮은 레이저 파워를 사용하여 광독성이 낮은 타임 랩스 이미징을 수행할 수 있습니다. FV3000의 이러한 속성을 통해 연구 그룹은 57시간 동안 타임 랩스 촬영 이미징 실험을 수행할 수 있었으며 빠르게 분열되는 미분화 ES 세포의 세 가지 정상 세포 주기가 완전히 적용되었습니다.

그림 2: Fucci(CA) 2.1로 표지된 쥐 ES 세포의 타임랩스 촬영 관찰

이미징 조건
표본: 쥐 ES 세포 
대물렌즈: 실리콘 이멀젼 대물렌즈(UPLSAPO30XS) 
현미경: FLUOVIEW FV3000 시스템
레이저: 445nm(AmCyan), 594nm(mCherry)

짧은 G1 위상의 검출

Fucci(CA)는 강력한 빨간색 신호로 G1 위상을 완전히 표지하며 이를 통해 미분화 ES 세포가 빠르게 증식하는 경우에도 위상 경계의 정확한 측정을 수행할 수 있습니다. 단세포 레벨의 타임 랩스 관찰을 통해 쥐 ES 세포(mESCs)가 약 11시간의 배가 시간과 1시간만의 G1 위상으로 증식되는 것이 밝혀졌습니다.

그림 3: Fucci(CA) 2.1 발현 단세포 핵의 형광 강도(F.I.)의 시간 프로필

그림 3: Fucci(CA) 2.1 발현 단세포 핵의 형광 강도(F.I.)의 시간 프로필

FV3000의 기능을 통해 이 실험을 수행할 수 있었습니다

전체 스펙트럼 시스템이 고감도를 제공합니다

FV3000 시리즈는 VPH(Volume Phase Holographic)기술을 사용하여 투과되는 빛을 회절시키는 Olympus의 TruSpectral 검출 기술을 이용합니다. 이 기술은 반사 유형 격자가 장착된 기존 스펙트럼 검출 장치와 비교하여 빛 처리량이 훨씬 더 높습니다.

낮은 여기광 하에서 높은 신호 대 잡음비(S/N)

FV3000의 고감도 검출기 장치에는 최대 45%의 양자 효율로 약한 형광 신호를 캡처하는 GaAsP 광전자 증배관(PMT)의 채널이 최대 4개가 있습니다. 또한 이들 검출기의 펠티어 냉각을 통해 백그라운드 노이즈가 20% 감소됩니다. 동시에 이들 특징에 따라 낮은 여기광 하에도 높은 신호 대 잡음비의 이미징 수행이 가능합니다.

생리학적으로 정확한 세포 주기 이미지 획득: Dr. Asako Sakaue-Sawano의 견해

미분화 mESC는 3차원(3D) 세포 배양 공간에서 분열 및 이동하며 XYZT 이미징이 증식을 모니터링하도록 요구합니다. 타임 랩스 이미징 수행 중 반복된 레이저 스캐닝은 광독성에 대한 높은 민감성으로 인한 미분화 mESC의 세포 주기 변화를 잠재적으로 유도할 수 있습니다. FV3000 현미경 시스템을 통해 Dr. Asako Sakaue-Sawano와 동료들은 부드러운 4차원(XYZT) 이미징 실험을 수행하여 단세포 레벨에서 빠르게 증식하는 쥐 ES 세포의 매우 짧은 G1 위상을 통해 전체 세포 주기의 특징을 정확히 규정할 수 있었습니다.

감사의 말
이 애플리케이션 노트는 다음 연구원들의 도움으로 작성되었습니다.
세포 기능 동역학 실험실, RIKEN 뇌과학 센터(Laboratory for Cell Function Dynamics, RIKEN Center for Brain Science) 

Dr. Masahiro Yo

Dr. Masahiro Yo
(이미징 실험 책임자)

Dr. Asako Sakaue-Sawano

Dr. Asako Sakaue-Sawano
(제1 저자)

Dr. Atsushi Miyawaki

Dr. Atsushi Miyawaki
(팀 리더)

참고문헌
이 애플리케이션 노트에 언급된 연구에 대한 자세한 내용은 다음 글을 참조하십시오.
A. Sakaue-Sawano, et al. “Genetically Encoded Tools for Optical Dissection of the Mammalian Cell Cycle.” Molecular Cell, volume 68, issue 3 (October 2017): pp. 626–640.e5.

이 애플리케이션에 사용되는 제품

컨포칼 레이저 스캐닝 현미경

FV3000

  • 검류계 전용(FV3000) 또는 검류계/공진(FV3000RS) 하이브리드 스캐너 구성에 사용 가능
  • 모든 채널에 정확한 고효율 TruSpectral 검출
  • 고광도 및 저광독성으로 라이브 세포 이미징 최적화
슈퍼 아포크로맷 대물렌즈

UPLSAPO-S/UPLSAPO-W

강력한 아포크로마트 대물렌즈로, 구면 및 색수차 보정과 가시광선에서 근적외선까지의 높은 투과율을 제공합니다. 생세포와 굴절률이 거의 일치하는 실리콘 오일 또는 잠입 매개물질을 사용하여 살아 있는 조직의 깊숙한 곳에서 고해상도 이미징이 가능합니다. 

  • 구면 수차 및 색수차 모두 보정 및 가시광선 에서 근적외선 영역에 이르기까지 높은 투과율 제공
  • 실리콘 오일 또는 잠입 매개물질은 살아 있는 조직의 깊숙한 곳에서 고해상도 이미징을 확보하며 굴절률이 살아있는 세포와 거의 일치하기 때문에 구면 수차를 줄이는 데 기여

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