세포 분석 소프트웨어와 True 3D 기술을 함께 사용하여 처리량이 높은 3D 오가노이드 이미지 처리 데이터를 분석하는 워크플로

서문

3D 오가노이드는 생리적 미세 환경을 모방하고 약물 반응에 대한 더 자세한 통찰력을 얻기 위해 사용되어 왔습니다. 오가노이드의 다차원 이미지 처리는 정보가 풍부한 데이터를 생성하여 여러 시간 지점에 대한 다량의 매개변수를 포착할 수 있습니다. 그러나 기존 이미지 분석 소프트웨어는 대규모 이미지 처리 데이터를 수집하기 위한 배치 분석 파이프라인을 설정하는 데 최적화되지 않은 경우가 많습니다. 직관적이지 않은 사용자 인터페이스와 복잡한 데이터 처리 단계는 처리량이 높은 이미지 분석을 어렵게 만듭니다. 이 연구에서는 보다 효율적인 3D 오가노이드 이미지 분석 워크플로를 구성하기 위해 올림푸스의 NoviSight™ 소프트웨어를 사용했습니다.

애플리케이션 워크플로

이점:

• 멀티웰 샘플의 3D 이미지 처리 데이터의 신속하고 효율적인 분석
• 각 배치별 매우 일관된 분석 가능
• 데이터의 상호적 프레젠테이션(썸네일 이미지 갤러리, 히트맵, 측정 표, 상관 그래프 및 게이트 설정)

실험: 대장암 환자에게서 유래한 종양 오가노이드에 대한 약물 치료의 성장 억제 효과

방법

오가노이드 배양

대장암 환자에게서 유래한 종양 오가노이드는 Costar® 96웰 플레이트(Corning)에서 성장했고, 임상 치료에 사용되는 여러 이리노테칸(IR) 및 5-플루오로유러실(5-FU) 희석액과 양성 대조군인 스타우로스포린(ST)으로 처리했습니다.

FV3000 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용한 컨포칼 이미지 처리

오가노이드 이미지 처리는 FLUOVIEW™ FV3000 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 수행되었습니다. H2B-GFP 분류 오가노이드 이미지는 10X 대물렌즈를 사용하여 획득했습니다. Z 스택 이미지는 5μm 단계로 획득했습니다.

NoviSight 3D 세포 분석 소프트웨어를 사용한 이미지 분석

1. 이미지 파일 로딩
   여러 이미지를 동시에 분석하기 위해 플레이트 전체의 이미지 데이터를 로드합니다.
2. 분석 수립
   “개체 설정”에서 각 채널 내의 개체 분할을 미세 조정합니다.
3. 분석 실행
   분석 설정 수립 시 플레이트 전체에 대한 분석을 실행합니다. 분석 역시 “배치 분석”으로 실행하여 다중 데이터 세트에 동일한 분석 워크플로를 동시 적용할 수 있습니다.

3D 오가노이드 이미지 처리 분석을 용이하게 한 NoviSight 소프트웨어 기능

분할 미리 보기

원하는 신호를 올바르게 검출하고 있는지 확인하기 위해 검출 임계치, 적응 강도 및 필터링과 같은 분석 설정에 대한 조정을 미리 보기 창에서 시각화할 수 있습니다. 이 미리 보기 창은 설정 재조정 없이 모든 웰 및 Z 스택으로 전환할 수 있고, 사용자는 전체 데이터 세트를 분석하기 전에 각 매개변수를 신속하고 종합적으로 미세 조정할 수 있습니다.

NoviSight 소프트웨어에서 분할 미리 보기: 조정 없는 원래 이미지(왼쪽) 및 개체 조정 설정이 적용된 후 검출된 GFP 신호를 보여주는 미리 보기 이미지(오른쪽)

그래프 게이팅

NoviSight 소프트웨어는 분석 실행 시 다양한 사용자 정의 그래프가 포함된 여러 개의 그림을 자동으로 생성합니다. 사용자는 이러한 그림을 통해 특정 매개변수별로 개체를 선택하고 오가노이드를 게이팅할 수 있습니다. 데이터포인트를 선택하면 원래 이미지의 해당 개체가 강조 표시되고, 이는 게이트 임계치를 설정할 때 유용합니다. 그 후 갤러리 뷰를 사용하여 게이팅한 개체를 전체적으로 표시할 수 있으며, 사용자는 대규모 데이터 세트에서 개체 분류의 정확도를 신속하게 평가할 수 있습니다.

각 웰에서 게이팅된 개별 오가노이드 표면적을 보여주는 산포도(왼쪽) 및 GFP를 사용하여 전체 플레이트에서 게이팅된 오가노이드를 표시하는 갤러리 뷰(오른쪽)

히트맵

NoviSight 소프트웨어는 사용자가 전체 플레이트의 데이터를 신속하게 살펴볼 수 있는 히트맵을 자동으로 생성합니다. 히트맵의 색 부호화는 추세를 강조 표시하고 불일치를 모니터링하여 데이터 분석을 간소화하는 데 도움이 됩니다. 또한, 웰을 선택하면 해당하는 원래 이미지가 강조 표시됩니다. 이 상호적 기능은 사용자가 전체 플레이트에 걸친 측정 또는 신호 분포를 편리하게 확인할 수 있기 때문에 이미지 처리 기반 분석 효과를 극대화합니다.

약물 처리 후 6일차 표면적 값의 히트맵. C 행 및 4 열은 미처리군입니다. D5~D9 웰은 각각 1, 0.1, 0.001, 0.0001μM ST로 처리되었고, E5~E9 웰은 각각 50, 10, 1, 0.1, 0.01μM IR로 처리되었으며, F5~F9 웰은 각각 100, 50, 10, 1, 0.1μM 5-FU로 처리되었습니다. 파란색: 넓은 표면적. 노란색: 좁은 표면적.

데이터 테이블

분석으로 생산된 데이터는 웰별로 각 측정값을 평균한 테이블로 통합됩니다. 프로그램은 각 평균과 관련된 오류를 제공하기도 하며, “표 다운로드” 기능을 사용하여 오류를 .csv 파일로 쉽게 내보낼 수 있습니다. 이러한 기능은 데이터 포인트를 수동으로 조작하거나 값을 계산할 필요성을 제거함으로써 사후 분석을 신속히 처리하고, 사용자에 의한 변수를 제한합니다. 산포도 및 히트맵과 마찬가지로, 데이터 테이블에서 값을 선택하면 사용자는 보기 창에서 해당 이미지를 확인하여 데이터 유효성 검사 프로세스를 지원할 수 있습니다.

각 웰에서 평균 표면적 값을 표시하는 데이터 테이블

진단 설정 및 재현성

데이터 분석이 완료되면 사용자는 NoviSight 소프트웨어에서 설정을 “진단”으로 저장할 수 있습니다. 그리고 이러한 사전 설정은 다중 시간 지점에 이미지 처리한 동일 샘플과 마찬가지로 비슷한 이미지 처리 조건 및 실험 매개변수가 포함된 다른 데이터 세트에 모두 적용할 수 있습니다. 이렇게 하면 데이터 분석에서 사용자에 의한 변수가 크게 줄거나 제거됩니다.

결과

오가노이드 크기

오가노이드 표면적은 처리되지 않은 모든 오가노이드 배양에서 시간이 지남에 따라 증가했고, 이는 오가노이드의 성장을 뜻합니다. 1μM ST 처리 결과 약물로 오가노이드가 죽으면서 표면적이 크게 감소했고, 수축을 유도했습니다. 50μM IR 처리로 표면적의 커다란 증가가 없어 완전한 성장 억제가 나타났지만, 100μM 5-FU 처리는 표면적의 미미한 증가를 통해 오가노이드 성장 억제에서 IR보다 덜 효과적임을 시사했습니다.

처리하지 않은 오가노이드 표면적의 시간당 변화, 1μM ST, 50μM IR 및 100μM 5-FU 처리. (ST: 대조군 n=153, ST n=208), (IR: 대조군 n=184, IR n=241), (5-FU: 대조군 n=172, 5-FU n=183)

오가노이드 형태

오가노이드 형태 변화를 정량화하기 위해 구형도를 측정했습니다. 처리하지 않은 군은 시간이 지남에 따라 구형도가 감소하였습니다. 1μM ST 처리는 구형도의 늦은 증폭을 유발했고, 오가노이드 염색과 관련된 구조적 평행 이동을 나타냈습니다. 50μM IR 및 100μM 5-FU 처리된 오가노이드의 구형도 측정 결과는 대조군에서 눈에 띄는 편차를 내지 못했으며, 최소한의 형태적 변화를 보였습니다.

처리하지 않은 오가노이드 구형도의 시간당 변화, 1μM ST, 50μM IR 및 100μM 5-FU 처리

결론 - 높은 처리량의 3D 이미지 분석에 대한 NoviSight 소프트웨어의 장점

NoviSight 소프트웨어를 사용하여 빠르고 효율적인 3D 이미지 분석 워크플로를 수립했습니다. 자동 생성된 히트맵과 같은 상호적 NoviSight 기능과 그림은 데이터의 대규모 볼륨을 시각화하고 추세를 한눈에 확인하는 데 도움이 되었습니다. 분할 미리 보기 및 진단 설정 저장과 같은 실용적인 기능은 모두 사용자가 더 일관된 결과를 생산하도록 지원하는 동시에 이미지 분석을 촉진합니다. NoviSight 소프트웨어의 이러한 요소들을 사용하여 4개의 시간 지점에서 3개의 서로 다른 약물 처리에 대한 3D 오가노이드의 7가지 형태 매개변수(표면적 및 구형도에 대해 표시된 데이터)를 측정할 수 있었고, 최종적으로 약물 반응을 평가할 수 있었습니다. 이러한 결과는 NoviSight 소프트웨어를 약물 스크리닝과 같이 처리량이 높은 이미지 분석 응용 분야에 사용할 수 있음을 보여주었습니다.

저자

• 남캘리포니아대학교 로렌스 J. 엘리슨 변형의학연구소 Brandon Choi, Seungil Kim, Jordan Gasho
• Olympus Corporation of the Americas 전략 프로젝트 관리자 Shohei Imamura