식물 접합체 배발생의 장기적 라이브 셀 이미징을 위한 실리콘 침지 대물 렌즈의 적용

식물 접합체 배발생

생명 과학 연구 분야에서 배발생에 관한 연구는 현미경 사용 기법의 발전과 함께 진전을 이루었습니다. 특히 동물 배발생에 관한 연구는 배발생 줄기(ES) 세포 같은 줄기 세포에 관한 연구로 발전하였습니다. 이와 대조적으로 식물 배발생은 오랫동안 연구가 이루어졌음에도 불구하고 동물 배발생보다 훨씬 덜 진전되었습니다. 이처럼 느린 진전의 주된 이유를 살펴보면 속씨식물 접합체가 모계 조직인 암술에 깊숙이 내재되어 있기 때문에 수정된 난자 세포(접합체)의 분열 과정에서 거주지 관찰이 어려운 것입니다.
Dr. Daisuke Kurihara가 주도한 연구 그룹인 나고야 대학 ERATO Higashiyama Live-Holonics 프로젝트의 광학기술그룹은 라이브 셀 이미징 및 미세한 세포 조작 기법을 사용하여 식물 생식계를 밝히기 위한 연구를 진행하여 왔습니다. 최근에 그들은 세계 최초로 식물 접합체 배발생 과정의 라이브 셀 이미징에 성공하였습니다. 이 작업은 매우 어려운 것으로 간주되곤 하였습니다. 일련의 연구 결과가 2015년 7월에 미국 과학 저널인 Developmental Cell*에 발표되었습니다. 본 연구에서는 특수 배지 및 새 마이크로 디바이스의 개발로 식물 접합체 분열 및 성장의 장기적 라이브 셀 이미징이 실현되었습니다.
이 애플리케이션 노트에서는 라이브 셀 이미징 전용으로 설계되고 본 연구에 사용된 실리콘 이멀젼 대물렌즈를 사용한 식물 접합체 배발생의 장기 라이브 셀 이미징의 예를 소개합니다.

실리콘 이멀젼 대물렌즈의 적용
애기장대 접합체 배발생의 장기 라이브 셀 이미징

１）살아있는 배주 내 배발생의 장시간 및 실시간 관찰을 위한 배양 방법의 설정

속씨식물 배발생은 암술에 깊숙이 내재되어 있는 배주 내에 일어나므로(그림 1) 생물의 접합체에서 배발생을 관찰하는 것은 불가능하였습니다.
Dr. Daisuke Kurihara가 주도한 연구 그룹인 나고야 대학 ERATO Higashiyama Live-Holonics 프로젝트의 광학기술그룹은 애기장대를 모델 식물로 사용하여 암술에서 배주를 제거한 후 체외 배양 조건에서 배주에 배발생을 가능하게 하는 배지의 구성을 조사하였습니다. 정상 배아 발육 및 배주 성장을 지원하는 배지 구성을 살펴본 결과, 유기물질인 트레할로스를 배주를 둘러싼 암술 조직인 난소에 추가하였을 때 배주 생존 및 정상 배아 발육의 주기가 크게 증가한 것으로 관찰되었습니다. 이러한 새 배주 배지의 개발을 통해 암술 밖의 배주 내에 있는 성숙 종자로 배아 발육, 발아 및 성체 식물로 묘목 성장이 가능하였습니다(그림 2).

그림 1. 애기장대 꽃과 배발생의 개략도
접합체는 배주에서 크게 늘어난 후 작은 끝세포와 큰 기저세포로 비대칭적으로 나뉩니다 끝세포가 배아를 발생시키고 배아는 성체 식물로 자라납니다.

7일차	10일차	14일차	19일차
26일차	32일차	37일차
그림 2. 배주 배지 내 묘목으로 그리고 묘목에서 성체 식물로 성장하는 초기배

다음으로 Dr. Kurihara 그룹은 안정적인 장기적 이미징을 가능하게 한 마이크로 디바이스의 개발에 착수하였습니다. 배주는 타원형이기 때문에 관찰 중에 움직이며 미세한 시야 밖으로 돌아다닐 수 있습니다. 이러한 속성 때문에 여러 날에 걸친 배발생 과정의 안정적인 거주지 관찰이 불가능하였습니다. 이 그룹은 배주를 안정적으로 유지할 수 있는 독자적인 마이크로케이지 어레이를 개선하여 마이크로필라 어레이를 개발하였습니다 이것이 배주 성장을 막지 않고 오랫동안 배주를 안정적으로 유지할 수 있는 새 마이크로 디바이스입니다. 이러한 새 마이크로 디바이스 및 배주 배지의 개발을 통해 고정된 위치에 배주의 안정적인 장기 배양을 위한 새 시스템이 설정되었습니다.

경사면보기	상면도
그림 3. 마이크로 디바이스를 사용한 배주의 고정 배주의 안정적인 장기적 유지를 위해 필라가 균일하게 배분된 마이크로필라 어레이가 사용됩니다. 배주 성장을 막지 않고 필라가 배주를 유지하기 때문에 배발생의 심층 관찰이 가능합니다. 기준자는 300mm를 나타냅니다.

２）애기장대 접합체 배발생의 장기적 라이브 셀 이미징을 위한 실리콘 이멀젼 대물 렌즈의 사용

후기배에 대한 세계 최초의 장기적 및 실시간 배발생 접합체 관찰은 여러 겹의 세포로 둘러싸인 배주 내에 있는 배아의 고감도 이미징 수행이 가능한 현미경 시스템과 상기 배주 배양 시스템을 결합하여 실현되었습니다.
본 연구에 사용된 고감도 현미경 시스템은 30´ 실리콘 이멀젼 대물렌즈 UPLSAPO30XS가 장착된 완전 전동 연구용 도립현미경 IX 시리즈였습니다.
실리콘 이멀젼 대물렌즈는 살아있는 조직의 굴절률(ne≈1.38)에 가까운 실리콘 오일의 굴절률(ne≈1.40)에 기초한 광학 설계로 라이브 셀 이미징 전용으로 사용됩니다. 이미징 실험에 사용된 30´ 실리콘 이멀젼 대물렌즈 UPLSAPO30XS는 광시야를 유지하면서 심도 있는 고화질 이미징에 필요한 1.05의 높은 개구수와 0.8mm의 긴 작동 거리를 가집니다. 기화로 인해 수분 공급이 필요한 워터 이멀젼 대물렌즈와 달리 37°C에서 여러 날 동안 작업을 해도 건조하게 되지 않기 때문에 실리콘 오일을 공급할 필요가 없습니다. 또한 실리콘 이멀젼 대물렌즈는 완전 전동 연구용 도립현미경 IX 시리즈의 Z-드리프트 보상 시스템 IX-ZDC와 호환됩니다. Z-드리프트 보상 시스템 IX-ZDC와 실리콘 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 지속적으로 초점이 맞는 라이브 이미지를 획득할 수 있습니다.
30´ 실리콘 이멀젼 대물렌즈 UPLSAPO30XS를 사용한 라이브 셀 이미징의 예로, 애기장대 배발생의 과정이 초기배(4-세포 단계)에서 후기 배아까지 67시간 동안 안정적으로 실시간 관찰되었습니다(동영상).

그림 4. 실리콘 이멀젼 대물렌즈를 사용한 마이크로 디바이스 이미징의 개략도
전동 XY 스테이지를 사용하여 멀티포인트 타임 랩스 이미징이 획득되었습니다

동영상. 접합체 분열 및 배발생의 라이브 셀 이미징
초기배(4-세포 단계)에서 후기 배아까지 배발생 과정이 10분 간격의 이미지 촬영을 통해 67시간 동안 녹화되었습니다. 동영상은 가로로만 분열하는 배병 세포에서 분열의 방향 및 막대 같은 조직의 형성을 변경하면서 전배 세포에서 원형 조직의 형성을 캡처하였습니다. 숫자는 녹화 시작부터 시간을 가리킵니다. 핵과 원형질 막은 녹색(H2B-GFP) 및 마젠타색(tdTomato-LTI6b)으로 각기 표지됩니다.

이미징 조건
이미징 시스템: 완전 전동 연구용 도립현미경 IX 시리즈
대물렌즈: 실리콘 이멀젼 대물렌즈 UPLSAPO30XS
공초점 스캐너 장치: CSU-X1(Yokogawa Electric Corporation)
EMCCD 카메라: Evolve 512(Photometrics)
전동 XY 스테이지: MD-XY30100T-Meta(Molecular Devices)
피에조 Z 초점 드라이브: P-721(Physik Instrumente)

라이브 셀 이미징 기술을 이용한 본 연구와 병행하여 Dr. Kurihara의 연구 그룹도 전체 식물에 대한 새로운 광학적 세정 기법인 ClearSee 방법을 개발하였으며 2015년 10월에 미국 과학 저널인 Development에 그 결과를 발표하였습니다.
새로 개발된 라이브 셀 이미징 기술과 식물에 대한 새로운 광학 세정 기법이 전 세계적으로 활용되어 식물 연구에 주요 발전이 이루어지기를 기대합니다.
 

이 애플리케이션 노트는 다음 연구원들의 도움으로 작성되었습니다.
Dr. Daisuke Kurihara, 나고야 대학 ERATO Higashiyama Live-Holonics 프로젝트의 광학기술그룹 그룹 리더

이 애플리케이션 노트의 연구에 대한 자세한 내용은 아래 글을 참조하십시오.

*출처: Dev Cell. 2015 Jul 27;34(2):242-51. doi: 10.1016/j.devcel.2015.06.008. Epub 2015 Jul 9.
저널: Developmental Cell
발표일: 2015년 7월 9일
제목: 애기장대 초기 배아 발생의 라이브 셀 이미징 및 광학적 조작
저자: Keita Gooh, Minako Ueda, Kana Aruga, Jongho Park, Hideyuki Arata, Tetsuya Higashiyama 및 Daisuke Kurihara

**출처: Development. 2015 Dec 1;142(23):4168-79. doi: 10.1242/dev.127613. Epub 2015 Oct 22.
저널:　Development
발표일: 2015년 10월 22일
제목: ClearSee: 전체 식물 형광 이미징을 위한 빠른 광학 투명화 시약
저자: Daisuke Kurihara, Yoko Mizuta, Yoshikatsu Sato 및 Tetsuya Higashiyama

장기간에 걸친 심도 있는 고화질 3D 라이브 셀 이미징의 실현을 위한 실리콘 이멀젼 대물렌즈

Olympus는 높은 개구수와 긴 작동 거리를 제공하는 30/40/60/100´ 실리콘 이멀젼 대물렌즈(UPLSAPO30XS/UPLSAPO40XS/UPLSAPO60XS2/UPLSAPO100XS)의 라인업을 갖추고 있습니다. 실리콘 오일의 굴절률(ne≈1.40)이 살아있는 조직의 굴절률(ne≈1.38)에 가깝기 때문에 굴절률 불일치로 유발된 구면 수차가 살아있는 두꺼운 조직의 관찰에서 감소되므로 고해상도 이미징이 가능합니다. 또한 실리콘 오일은 건조하게 되거나 고체화되지 않기 때문에 침액을 따로 공급할 필요가 없습니다 실리콘 이멀젼 대물렌즈는 완전 전동 연구용 도립현미경 IX 시리즈의 Z-드리프트 보상 시스템 IX-ZDC와 호환됩니다. 지속적으로 초점이 맞는 장기적인 안정적 고해상도 3D 이미징이 획득되며 기온 변화나 시약 용액의 추가로 인한 영향을 받지 않습니다.